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标题:【求助】MTT的具体做法及原理意义

bananapeople[使用道具]
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1
 

【求助】MTT的具体做法及原理意义


最近要做细胞损伤与调亡的检测,用MTT法,我是新手,所以想向高手们请教:MTT的具体做法及原理意义,多谢!
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ha111[使用道具]
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最好看书吧,内容比较多,在这里说不清楚。
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园丁##[使用道具]
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以下的protocol供参考:
--1. Make a solution of 5 mg/mL MTT1 dissolved in PBS and filter sterilized.
--2. 5 hours before the end of the incubation add 20 uL of MTT solution from step one to each well containing cells.
--3. Incubate the plate in a CO2 incubator at 37 oC for 5 hours.
--4. Remove media with needle and syringe.
--5. Add 200 uL of DMSO to each well and pipette up and down to dissolve crystals.
--6. Put plate into the 37 ºC incubator for 5 minutes.
--7. Transfer to plate reader and measure absorbance at 550nm
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mickeylin[使用道具]
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4
 
MTT 理论可以参见司徒镇强,吴军正主编. 细胞培养. 西安:世界图书出版社. 1996.

MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 四唑盐. 实验结束前,如杀伤实验或生存曲线培养48h后,加入5mg/mL的MTT 10μL,继续培养4h后离心弃上清,加入DMSO150μL溶解MTT,选择490nm或550nm波长,在酶联免疫检测仪上测定OD值。

有3体会:
1.MTT的量各家报道不同,一般是过量的,所以10ul即够了。
2.贴壁细胞效果好,悬浮细胞要离心2500rpm×10min,室温, 再吸去培养液,加入DMSO。
3.如果实验孔不多,DMSO加入后可以用枪头吹打混匀,比振荡溶解效果好。
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xueyouzhang[使用道具]
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相关疾病:
肿瘤
我读书时应用MTT作肿瘤细胞株药敏,采用以下文献“周建军,乐秀芳,韩家娴,等。评价抗癌物质活性的改良MTT方法。中国医药工业杂志 1993;24(10):455-6”。该方法为上海中科院细胞所所采用,MTT产物应用三联液溶解彻底,不需振荡,对于悬浮细胞尤其适合,且产物稳定。对于贴壁细胞,他们那时采用SRB方法。
简要方法(我的肿瘤药敏实验):
1. 将一定密度的肿瘤细胞90μl/孔接种于96孔微量培养板内,然后加入药液10μl/孔,每种药5个浓度(每个浓度相差10倍),一个浓度设4个复孔。每块板设一个空白调零孔,内加培养液,不含细胞与药物。每种细胞设6个正常对照孔,加样100μl/孔,不含药物。接种完毕后在37℃, 5%CO2条件下孵育培养48小时。
2.加MTT:
加MTT溶液(5mg/ml)20μl/孔,混匀后37℃,5%CO2 条件下孵育4小时。
3.加三联液:(三联溶解液:SDS 10g, 异丁醇 5ml , 10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液)
加溶解三联液100μl/孔,混匀后37℃放置过夜以溶解甲臢。
4.吸光度(A)测定:
用酶标仪测定每孔吸光度,测定波长为570nm,校正波长为630nm。
5.计算:肿瘤抑制率=(对照组A值-治疗组A值)/对照组A值×100%, IC50值用Logit法计算。
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生物迷[使用道具]
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相关疾病:
肿瘤
  MTT原理简单说就是:MTT能被活细胞的酶作用,从而发生变色,变蓝!!
  用OD550/OD490策的吸光度,活细胞多则吸光度大,反之则吸光度小。从而反映出你的细胞的死亡率,即药物的作用!
用来检测凋亡,用于抗肿瘤药物的筛选,在美国的很多公司,也用它来粗筛!
  我就做过肿瘤药物的筛选,很方便,96孔板做机组不同的药物浓度,分设阳性药物、阴性对照(也作不同梯度),对比结果既可!
我觉得其中的难点是:
1、细胞分板时,要充分分散,而且要家几个空就重新吹散一次,否则,细胞浓度就会不同。(我曾经试验过,用后加的孔作试验组与用先加的孔作对照组,结果有些差异,也许是我的熟练程度不行!)另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。
2、培养后,细胞的培养既要吸干净,否则,残留的蛋白会对MTT有一定的吸附作用,影响就过准确性。我使用的是翻转法,将培养液倒掉,这样做很简便,又很快洁。重复性也不错。
3、测吸光度值要有一定的时间范围,在测定是你会发现,随着时间的推移没空都会变深些,(这可能是由于MTT在空气中氧化的结果,我记不清了,你再找找书,另外,具体时间我也没有记清)
4、养性药物的选择,要选择经典的,有说服力的,又对你的细胞有很好的杀伤了力的药物。别认为简单,我就曾经因为阳性药物选择错误而重新做试验,惨痛的教训呀!!
  希望试验成功!!
希望试验成功,成功了要来说一下经验及教训,大家共勉!!
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tieshazhang[使用道具]
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MTT有下面一些优点:
1、有灵敏度高,重复性好,
2、操作简便、经济、快速、易自动化的优点,
3、而且没有3H—TdR掺入试验放射性污染,
4、还可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素
所以可以选择这种实验方法
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dog002[使用道具]
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请问,做完MTT的96孔板可以保存多长时间在4度条件下,还有我想问一下用450nm是否可以,因为我们实验室的490nm坏了,而在看到你的发言之前我也不知可用550nm测量,多谢!
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wood533[使用道具]
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我有幸听到司徒先生授课:
1、制备单细胞悬液:0.25%胰蛋白酶消化,用培养液配成细胞悬液
接种细胞:每孔103-104细胞(100~200ul)接种于96孔板中
2、预培养:37℃,5%CO2及饱和湿度下培养24h
施加影响因素:如药物,培养3-5天
3、加MTT (0.5%) :每孔10~20ul,培养4~24h
4、溶解结晶物:吸弃孔内培养液,勿破坏孔内结晶物,每孔加入150ulDMSO,震荡5-10分钟
5、比色:选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,先调零(按调零键),再按统计键,然后各孔分别按测量键,最后按统计键,自动打印比色结果
6、绘制曲线:以细胞数或作用因素(如药物浓度)为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制曲线
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04906[使用道具]
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究竟是用490nm还是570nm?为什么各家说法不一?
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