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标题:【求助】请问有人用过结晶紫染色法吗?

tuomu45[使用道具]
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【求助】请问有人用过结晶紫染色法吗?


文献上说用结晶紫染色法检测活细胞数,但我查了一些资料,这种方法有多种具体操做法,不知该用那个好,请教哪位战友做过,具体说一说!不胜感激!
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hyuu[使用道具]
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含0.2%的结晶紫的80%甲醇固定细胞并染色10分钟,冲洗3遍,加入2%SDS裂解细胞,546nm酶标仪比色,类似MTT方法。
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dotaaa[使用道具]
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0.5%结晶紫15分钟,烘干,1%SDS振荡溶解,上机(根据自己实验室的酶标仪选择波长)读取吸光度值
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dotaaa[使用道具]
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0.5%结晶紫15分钟,烘干,1%SDS振荡溶解,上机(根据情况选取波长)读取吸光度值.
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tuomu45[使用道具]
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看,这就有两种方法了,我用哪个好呢?
还有,你们配过结晶紫溶液吗?结晶紫俱难溶,我按照一篇文献上说的,先用乙醇溶解,再加水,可事实证明还是溶不了。你们有什么好方法吗?
此外,你们觉得结晶紫染色法最后读数深吗?我试了一次,没加样品,都觉得颜色很浅,这样的误差会很大的。你们是怎么办的?
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qqq111[使用道具]
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文献上说用结晶紫染色法检测活细胞数,但我查了一些资料,这种方法有多种具体操做法,不知该用那个好,请教哪位战友做过,具体说一说!不胜感激!

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染活细胞最好用台盼蓝排斥试验(trypan blue exclusion test)

原理 细胞膜受损的细胞,因通透性改变可染成蓝色。
试剂 0.4%的台盼蓝溶液
操作方法 在试管中加入0.5 ml 0.4%的台盼蓝溶液和0.5ml细胞悬液,彻底混匀,室温放置10min,然后在4℃ 500g离心沉淀10min;弃上清夜,将沉淀重新悬浮于1ml PBS中,吸取一小滴在显微镜下观察。染成蓝色的细胞即为死细胞。

实际操作时不必如此,只需吸10ul 0.4%的台盼蓝溶液+10ul细胞悬液,混匀后镜检,数200个细胞,计算未染色细胞的比例即可。
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tuomu45[使用道具]
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原理 细胞膜受损的细胞,因通透性改变可染成蓝色。
试剂 0.4%的台盼蓝溶液
操作方法 在试管中加入0.5 ml 0.4%的台盼蓝溶液和0.5ml细胞悬液,彻底混匀,室温放置10min,然后在4℃ 500g离心沉淀10min;弃上清夜,将沉淀重新悬浮于1ml PBS中,吸取一小滴在显微镜下观察。染成蓝色的细胞即为死细胞。

实际操作时不必如此,只需吸10ul 0.4%的台盼蓝溶液+10ul细胞悬液,混匀后镜检,数200个细胞,计算未染色细胞的比例即可。

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但我看的大部分文献上对我这个实验都是用结晶紫染色,只有少数几篇用MTT法,我想应该来说,对这个实验而言还是结晶紫法最经典吧。
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misswu61[使用道具]
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其实原理都是一样的,活细胞的膜完整,不能被染上染料的颜色,而死细胞则被染上色。
我用过多种染料,其实都一样。
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wu11998866[使用道具]
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我想也是,但就这个实验而言,还有很多具体的问题。比如结晶紫的浓度,染色时间等等,到底这些条件有无影响呢,这些条件各起的作用是什么呢?我更想知道的是这些,而且我想如果哪位战友做过的现身说法就更好了。
我使用的方法是,每孔加入0.5%结晶紫100微升,染色1小时后,离心弃上清,用PBS洗细胞1次,每孔加入1%SDS后,于546nm波长下,测定OD值。这是结合了文献的,把1%的结晶紫改为0.5%,加200微升改为加100微升。但我上面的帖子也说了,我遇到的问题,不知是何原因引起的?
此外,还有一个俱麻烦的方法,体外细胞结束培养后,去培养液,加入11%的戊二醛固定,于振荡器上摇20min,用去离子水洗涤,置空气或烘箱37度干燥,加入0.1%的结晶紫液对细胞染色,振摇30min,用蒸馏水洗涤,再干枣,加入10%乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取,1h后在酶标仪上测定光吸收度,波长为595nm.
这个方法太麻烦了,所以我没用。
还想问一个问题,波长有要求吗?我查到的就有4个波长。
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