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标题:【求助】求助有关流式的几个问题

DNA[使用道具]
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发表于 2012-10-7 14:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】求助有关流式的几个问题

1。我做了好几次周期分析了，总是死细胞很多，有的结果干脆就不能用。我分析了一下，原因有2：我培养的细胞不好消化，所以我消化时间比较长，并且吹打次数比较多，这样细胞受损比较大；另外我用含1%TRITON的染色液边通透边染色，作用30分钟，鉴于TRITON的作用强烈，对于我已经受损的细胞，30分是不是太长了？或者1%太大？
2。我还做膜表面黏附分子（CAM）检测。如果当天不能上机，有什么办法可以保存样品呢？？？

请版主赐教！多谢！
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DNA[使用道具]
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发表于 2012-10-7 14:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
补充一点：
检测CAM的抗体是直标的，一个PE标记，一个FITC标记。
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发表于 2012-10-7 14:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #3 kent 的帖子

染DNA，
实际上在加了TRITON和其他试剂后，终浓度一般会降至0。5%，是不是还是高？

4度过夜，是指加了抗体就让之孵育过夜吗？
如果周期分析也想过夜，是不是缓加至冰乙醇中？

谢谢你！！
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-10-7 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

次日上机检测还应该通过多聚甲醛固定或者用乙醇固定，固定后可不必强调避光，但是应放置于4℃中保存。
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DNA[使用道具]
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发表于 2012-10-7 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你是指周期分析还是分子检测？？
是指加了抗体之后再固定？？还是固定过夜后，第二天染色？？
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-10-7 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现我们实验室做细胞周期已不用通透液了，连RNA酶也不用。细胞洗完后缓慢加入70%的乙醇，24小时后PI染核，30分钟内流式检测。细胞用乙醇固定后可以1个月内检测，实验结果与经典方法是一致的。
标记抗体30分钟后洗两遍，加入1%的多聚甲醛，这样可以隔日直接上机检测
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duoduo[使用道具]
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发表于 2012-10-7 14:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多少毫升的1%的多聚甲醛，加入多少微升的细胞悬液中呢？

我想知道一个详细的步骤！
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发表于 2012-10-7 14:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 duoduo 于 2012-10-7 14:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
多少毫升的1%的多聚甲醛，加入多少微升的细胞悬液中呢？

我想知道一个详细的步骤！

1%~4%的多聚甲醛都有人用，但因为多聚甲醛有挥发性，我们实验室常常配成4%的。最后一次洗细胞，离心弃上清时一般管里还会残留一点液体，有30微升左右，先用vortex振荡混匀，使细胞重悬。然后边振荡边加入多聚甲醛，以防止细胞成团。

至于多聚甲醛的用量是根据样品中的细胞数确定的，也就是最后上机检测时使细胞达到合适的浓度。因为细胞过浓，激光打在液柱上时，细胞间有可能互相阻挡，导致检测不准确；细胞过稀，每个样品检测时间太长，耽误时间，也损耗激光，浪费鞘液。个人认为表型检测时，检测速度在200~400细胞/秒比较合适。一般10 6细胞加400微升多聚甲醛比较合适，上下波动可以根据自己的经验。
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发表于 2012-10-7 14:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 DNA 于 2012-10-7 14:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1。我做了好几次周期分析了，总是死细胞很多，有的结果干脆就不能用。我分析了一下，原因有2：我培养的细胞不好消化，所以我消化时间比较长，并且吹打次数比较多，这样细胞受损比较大；另外我用含1%TRITON的染色液边通透边染色，作用30 ...

你能把你的染液配方写下来吗？你的细胞是不是用70%乙醇固定后染PI？
我们用的PI染液里TRITON的浓度是0.1%。时间倒是问题不大。

膜表面分子的检测，你说当天不能上机，第二天能上机吗？你想保存多久？
一般染完抗体后（室温20min足够了，时间长了增加非特异性结合），PBS离心洗涤2次，弃上清后根据我上一个帖子的方法用多聚甲醛固定，4度避光保存（要避光，因为抗体上标记的荧光染料长时间暴露于光线会衰减），第二天上机检测是没问题的。
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发表于 2012-10-7 14:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢！
我用的染液，是逐个加的。离心弃液后一般有50微升残留，我再加1%TRITON（PBS中）和PBS至TRITON终浓度为0。5%，加10微升10mg/ml RNaseA,10ul的500ug/ml PI。37度孵育30分钟后上机检测。

后来我使TRITON的浓度降至0。3%，果然死细胞数降低了，结果变好乐。看来可以再降一些，是不是？

做周期的样品，我用75%的冰乙醇固定过一次，是把细胞悬液逐滴加入5毫升乙醇中。检测时离心去除，PBS洗1-2 次，加染液孵育后上机。但是这样检测时死细胞（碎片）非常多，甚至做不出结果来。可能由于我的细胞难于消化，在制备细胞悬液时机械吹打过多等原因导致细胞状态不好，不适于固定。

另外你说直标的CAM抗体只需孵育20分？我们实验室一般37孵育1小时；4度1小时以上的？？如果非特异结合增高，在结果的各参数中，能否表现？？
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