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标题:【求助】有关于MTT的详细方法的介绍么？？

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-10-7 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】有关于MTT的详细方法的介绍么？？


我是刚接触实验，什么都不懂
要用它来看肝细胞的活率
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tieshazhang[使用道具]
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发表于 2012-10-7 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT，原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶formazan，后者的产量与活细胞数成正相关。formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长560nm进行比色。所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。
优点：灵敏度高，操作简便，自动化。
缺点：影响因素多，重复性较差。
注意：MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护。
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-10-7 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是想要他的实验方法
就是,怎么加,加多少?怎么处理?怎么看结果?
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2012-10-7 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般我们是用96孔板来做细胞MTT实验。
1.细胞铺板
2.配制5mg/ml的MTT溶液（溶于0.1M PBS）,过滤(但是我实际上发现不过滤对实验也没有影响)。
3.每孔加入20 微升MTT溶液，37度孵育4小时后，小心吸出孔内培养基，可见孔内有蓝紫色结晶物。
4.每孔加入DMSO 150微升，振摇10min，490nm处用酶标仪测量每孔吸光度。
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u234[使用道具]
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发表于 2012-10-7 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
肿瘤
我平时用的MTT方法：
1）在96孔板中加入细胞悬液，180ul/孔（有的人也加100ul/孔，加180ul是因为我加20ul 的药物处理，相当稀释了10倍，易于计算），调整细胞浓度使每个孔中细胞数在10000个左右。
2）细胞在37℃，5%CO2 条件下孵育24小时，然后加入药物或进行其它处理
3）根据你的实验设计在37℃，5%CO2 条件下孵育相应时间（我经常做24 、48、72小时的细胞生长抑制率）
4）孵育完，每孔加入20ul 5mg/ml 的MTT，37℃，5%CO2 条件下孵育4小时，弃上清（如果是悬浮细胞，离心后弃上清），每孔中加入100ul 的DMSO溶解MTT产物甲臢， 振摇10min,在570nm 测吸光度。
我平时是用MTT方法筛选抗肿瘤药物，可能你用来测肝细胞的活率所用的细胞数等条件还需要再调整。
还有注意的是MTT有毒，配的时候小心，而且容易分解，闭光保存。
丁香园中关于MTT方法的讨论挺多的，可以看看别人的帖子，会有不少收获。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/181250')
不知道我说明白了没有，如果还有问题，可以跟贴讨论。
祝好运！
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xue258[使用道具]
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发表于 2012-10-7 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
悬浮细胞和贴壁细胞的MTT法有差别,溶解剂要有所选择,我做悬浮细胞溶解剂用的是SDS-DMF(效果较好,不用弃上清),贴壁细胞的选择范围就广一些,你可以根据自己的具体实验选择.
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-10-7 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢大家，非常有帮助，谢谢！！
另外，要是没有专用的离心装置，直接用原液测量吸光度行么？
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-10-7 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
悬浮细胞和贴壁细胞的MTT法有差别,溶解剂要有所选择,我做悬浮细胞溶解剂用的是SDS-DMF(效果较好,不用弃上清),贴壁细胞的选择范围就广一些,你可以根据自己的具体实验选择.

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学兄，可不可以稍微具体一点说一下你做悬浮细胞的MTT的方法。
我做了几次，发现重复性不如贴壁细胞好，不知道该怎么处理，多谢多谢!
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ffooll[使用道具]
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发表于 2012-10-7 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是淋巴细胞，也没有很多经验，只是觉得加样细胞太少就不容易出结果，我用的是无酚红的1640，血清在培养基中月7%，溶解剂是SDS-DMF，比较好，他可以在不弃培养液的时候加进去溶解，而且吸光度在很长时间内变化不是很大，当然听说三联液也不错。
贴壁细胞没做过，我们实验室有人作过，我可以问问。
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-10-7 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的意思是说在药物作用后，直接加MTT,然后直接加SDS-DMF就行了，那需要加多少，96孔板中的溶液量不是很多吗？
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