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标题:【求助】关于k562细胞的培养及形态

summerxx[使用道具]
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【求助】关于k562细胞的培养及形态

相关疾病:
肿瘤
本人第一次作细胞培养,诚惶诚恐,细胞培养的书看了不老少,培养的细胞也是据说很好培养的肿瘤细胞K562,但还是遇到不少问题,请各位高手指教:
------我的培养过程:6天前下午自细胞所拿来细胞株,未作处理酒精擦瓶后放入培养箱,过夜后,观察细胞发现细胞大小不一(请教了细胞所的老师说其形态是这样),作了活力为85%,实验室做干细胞培养的老师帮我做了个离心涂片,并常规染色,发现细胞胞浆很不规则-,有伪足----形象点描述是不少细胞都长了小耳朵(圆圆的,就象细菌出芽!可惜未能拍陈照片,不然可以让大家看看)----好像细胞所没做过问他们也不知道。于是将细胞由原来的25ml的玻璃瓶换为我们的一次性50ml的大瓶,加入了新的培养基(用的是GIBCO的1640加入10%胎牛血清),第二天发现细胞长得不少,可见白色絮状物(更有点像烧开水后的白色沉渣,粉状的),但离心计数细胞并不太多,分为两瓶,各加入新鲜培养基10ml,三天后,细胞长得很多,有很多肉眼可见的白色沉淀,摇晃后培养也挺混,镜下看细胞很多,有不少个头挺大的细胞,还有很多细胞形态不规则(好象有些破了),折光性也不好,倒没见有明显的污染情况。
请教:1、正常培养的活力好的k562细胞是什么样的形态?是大小差别很大吗?有没有人观察过这个培养细胞染色后的形态?我的细胞染色后的形态(有伪足)是正常吗?
2、细胞形态不好是我的培养过程有什么问题吗?是细胞换了环境发生的改变?还是污染(应该不会因为这些步骤都是实验室的老师帮我做的,我还未敢动手,所以污染的可能性还小些。)?
3、下一步我该怎么办?是再培养看看?或是在重新购株(哎心痛银子,不到万不得已实在不想用)?
请大家帮忙分析指教一下
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K562细胞换一个新环境是受些影响的,如你培基的PH、培养箱的各个指标的不同等,但他们是有很强的适应能力,只要你没有污染,继续养一段时间就会好的。注意接踵的细胞密度要适中1X105/ml,太多太少都会有影响的。从你的叙述来看细胞密度是太大了,下次传代时你要是估计不好,可记下数,最好用台盼蓝拒染法,这样可以观察细胞的活力。
正常培养的活力好的k562细胞在10倍倒置显微镜下折光性很好,若不好代表它的状态差。但它们的大小是不一致的。尤其状态不好时他们的大小差别更大。可以将血清的浓度加大一点,等他们状态好后在调回。
你说:“常规染色,发现细胞胞浆很不规则-,有伪足----形象点描述是不少细胞都长了小耳朵”,这也是正常的,因为他们中有很多原始细胞,那是原始细胞的形态。我有很多他们的形态,可惜我不会上传照片,不然可让你看看。
总而言之,我个人的意见是:你的细胞状态不太好,原因有一些,只要你继续传下去,一定会好!但你应时刻注意不要污染。欢迎有疑问继续提,我养了两年多的K562,现在还在养。说不定我也可以从你的问题中注意一些细节。
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细胞状态不好可能的原因主要是代次和污染;从你的情况看污染基本可以排除。肿瘤细胞常规讲是无限传代,但是超过50代以后状态还是要差一些!!!细胞的形态不一致不要紧,应看总体形态。2001年我们用的天津血液病研究所的K562细胞,状态较好,如方便可与他们联系。注意的是细胞状态不好应及时处理,找出原因,否则劳民伤财!
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summerxx[使用道具]
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谢谢楼上两位的建议,经过这两天看了细胞,发现形态好了些,折光性也还好,细胞活力也作了还不错,Luck-tang兄分析的很对,可能还是改变环境引起的问题,而且我接种的密度也大了,不过不只知是进口的培养基“太好了”,还是k562本身就长得快,我上次下午1传3瓶,第二天下午一看,天那又长满了!根据老师的意见我把一部分细胞冻了起来,另一部分继续培养。
gaohang兄说的也很有道理,我实验室的老师几次养细胞都发现细胞开始形态还好,等传了几代以后就不行了,她认为还是根原始的细胞株的问题(细胞所往往只给培养几天那时态还好)。
我还有个疑问,实验室的老师告诉我细胞传代多了,细胞性质会发生改变(可能会与细胞株有很大别),那么像这样的肿瘤细胞我如何监测它是否改变了?通过形态?还是一些特异性的监测?那么是么时间需要做呢?
谢谢!
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我的建议是做个细胞核型鉴定,看看它的Ph染色体是否还存在。再者找到它建系的原始文献,看看它的其它特征,然后你再检测一下是否发生改变。
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summerxx[使用道具]
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谢谢,我倒是接触过一点核型分析的方法,只是会做但不会看(不过异常染色体可能能好认点),我下一步要提mRNA作BCR-ABL的RT,估计我的细胞应该还是好的(毕竟刚拿来,不然以后的工作就麻烦了)。不知Luck-tang兄认为在什么时间做这些检测好?比如形长时间培养后或是发现形态改变?一般要传多少代后需作呢?而悬浮细胞我想只在光镜下大约看不出什么太大的变化,我的实验周期大约要3-5个月,需不需要做这些鉴定?还是在实验前都应该做一下?Luck-tang兄一般都什么时间、怎样作?Luck-tang兄已经作了两年培养,一定经验丰富,介绍一下你的经验可以吧?
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fei1226com[使用道具]
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我请教一个关于K562的问题:如果要在24孔板里培养,是否需要底是凹状的培养板。平的不行吗?
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平底可以!
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回复 #6 summerxx 的帖子

我个人认为,在买细胞回来后就应该做,因为你怎么确定人家卖给你的就是K562呢?他们有没有自己搞错了呢?尽管可能性小,但你自己心理要有十足的把握它就是你要的细胞株,这样你才好开展你的实验。你首先确定你需要做哪些方面的,有些不会的就请相关专业人士帮指导!我个人做得不多,我们这有专门的做染色体的人员!我只需要吩咐她们做,然后将结果给我。你们若也有这种条件,你也可以这样!如果你需要方法我可以要她把方法提供出来!
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XYZQ[使用道具]
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回复 #7 fei1226com 的帖子

楼上说的对!平底就行。细胞密度和在培养瓶中培养一样。
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