【讨论帖】脐静脉内皮细胞培养建议

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标题:【讨论帖】脐静脉内皮细胞培养建议

兔唇[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.取样：脐带最好是没有取过脐带血的，长度一般在15－20cm.另外，脐带最好是刨腹产的，而且整个脐带不能有止血钳的夹痕。
2.运输：脐带最好要快速运输，主要可以用D-Hank's或培养基，还有其他和正常生理条件差不多的液体。
3.消化：此步骤是脐静脉内皮细胞培养最关键的一步，消化的酶我主要推荐Roche 的 Collagenase A，效果很不错；可以配制好后冻存使用。另外，最重要的是消化的时间，时间太短可能会损失一部分内皮细胞使其不能达到正常的生长密度而死亡；如果消化的时间太长又会引进一些杂细胞，如平滑肌细胞、纤维细胞等，这些都会影响内皮细胞的正常生长；我个人认为消化的时间要以脐带的长短而定，一般15－20cm的脐带大约需要10min,37度。
4.培养：脐带内皮细胞一般都培养在用1％明胶包被好的培养瓶中。原代用20％的小牛血清，以后就用10％的小牛血清。

ha111[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教:
你的细胞一般能传几代?
用什么培养液?

kulee[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教：
1、消化放在哪里？止血钳很长，放进饭盒很困难。
2、你冲洗动脉吗？我回收的消化液中有大量的红细胞，据我观察来自于动脉，上次我把动脉结扎了，也有很多红细胞。
3、如果你在上海，能否容许我到贵实验室学习？我已做了两个月了，快崩溃了！到时重谢！

大白菜[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 kulee 于 2012-10-9 15:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教：
1、消化放在哪里？止血钳很长，放进饭盒很困难。
2、你冲洗动脉吗？我回收的消化液中有大量的红细胞，据我观察来自于动脉，上次我把动脉结扎了，也有很多红细胞。
3、如果你在上海，能否容许我到贵实验室学习？我已做了两个月了 ...

1. 消化时放在一个无菌托盘即可，盘内放置D-Hanks
2. 缝扎动脉很有必要，脐带最好也采用缝扎的方法，损伤小、效果好！
3. 培养及最好用M199-20%FBS，DMEM-20%FBS效果不如前者
4. 一根20cm的脐带加入30-40ml 0.1%IV Collagenase，37度15min，可收获细胞约20000-30000。

kulee[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我冲洗和注射胶原酶使用16号针头，用丝线结扎发现扎不住，针头经常掉，所以还是用止血钳，不知你用何办法？
希望能看看你分离细胞过程，我闭门造车已两月了，我们学校没人做这项工作，我参考文献分离，对很多细节不了解，不知能否看看你们如何分离？
谢谢！

大白菜[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #5 kulee 的帖子

根本无须针头，直接用注射器前面的接头注射，或连接一段输液用导管，效果很好，操作是最好有个助手帮忙。

没什么细节，细心点就好！

moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于脐静脉内皮细胞培养，我个人认为：
1. 脐带要尽量新鲜，4℃条件下保存时间不宜超过4个小时；
2. 胶原酶消化效果很好，但Roche的胶原酶有点贵，可以尝试用0.25%胰酶＋0.02％EDTA-Na2（pH调至7.4左右，不要太高！），37℃消化10min左右。我以前试过的，效果还不错。
3. 冲洗和灌注脐带时可以使用三通管，很方便，结扎后也不容易脱落。
4. 消化时可把脐带放在装有PBS或者Hanks液的烧杯中37℃水浴。
还有更多细节，需要自己慢慢体会哦

大白菜[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实胶原酶还不算太贵,我使用GIBCO的,350元左右,够3-4次用,效果很好,最关键的我倒不认为是实验操作者自己,而是脐带本身,建议从剖腹产术中获取,更为清洁,否则,不管操作者如何小心细致也没有用,因为在分娩的时候脐带已被污染!唯一可能解决的办法,在培养基中放入高档抗生素,如2-3代头孢,我试过,能杀灭污染的细菌,美中不足的是会影响内皮细胞的生长!

ha111[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教几个问题：
1、用0.25%胰蛋白酶消化12min，有少量血细胞，镜下见大量圆形细胞，用国产胎牛血清10%，GIBCO RPMI-1640培养基培养，但贴壁的细胞很少，是什么原因？
2、进口一次性培养瓶还需要用明胶处理吗？

谢谢赐教！

dog002[使用道具]
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发表于 2012-10-9 15:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

以前也有一位同学问过我类似的问题。我把问题和答案附上。
我有一位同学一直养不好，想向你请教一下：
> >>1.主要依据那些参考文献，是否必须要用细胞生长因子；
> >>2.分离过程中需要注意的细节
> >>3.他现在用胰酶消化（37℃，约20分钟），RPMI-1640及国产小牛血清培养（原代用到30），第一天观察到有细胞贴壁，第二天观察到有细胞抱团的现象，然后细胞愈来愈少。不知为何？

我们的分离脐静脉内皮细胞（HUVEC）的protocol:
无菌收集足月顺产的胎儿脐带长约20～30cm，剪去破损或有夹痕及血肿部分，脐静脉两端插入注射器前面的接头插管，用手术线系牢。用D-hanks冲洗至静脉内无血，用止血钳夹住一端插管，另一端注入0.25的胰蛋白酶，使之充盈后夹闭脐带，将其放入无菌容器内，37℃保温15～20分钟。用D-hanks冲洗至加有少量血清（中和胰酶）的50ml离心管中。20-25℃ 1200rpm离心10分钟。用5-10ml 含20血清的M199重悬细胞，将细胞移入0.2％明胶包被过的培养瓶中，37℃培养过夜，换液，以后隔天换液。当细胞融合后传1～3代。备用。
没有参考文献，这是很成熟的，常规的细胞操作。
需要注意的几点：
1。要保证HUVEC都消化下来：A，消化前尽量把脐带内的血冲干净，不然一方面影响消化效率，后面对HUVEC的贴壁和生长都有影响；B，灌注足量的胰酶消化液，但同时要保证37℃温浴时不漏液。这需要灌注消化液后将脐带两端结扎紧。C，消化时间自己摸一下，太短消化不足，太长损伤细胞活性。
2。操作全过程应保持无菌，否则原代HUVEC很难生长。
3。尽早去掉多余的红细胞。一般在4－6小时后，HUVEC即可贴壁，这时就可把悬浮细胞吸出弃去。
4。促进HUVEC贴壁，我们一般一根脐带消化后的细胞养在一个T25的塑料培养瓶中。如果有必要，可以事先在瓶内铺一层明胶：配0.2％明胶(0.2g溶于100ml双蒸水中消毒灭菌)，加2ml于每个培养瓶中，晃动使底面铺满，30分钟后把多余液体完全吸出即可。
5。我们用20％血清的M199，不加因子，加VEGF或FGF更好。
就你朋友的情况，可能是红细胞去的太晚，或有污染。注意以上几点，多做几次后就会有经验了。一定会做出来的。