液相色谱

我想走一个pH梯度，在pH3时，不出峰，在pH2.5时死时间出峰，为什么走线性梯度pH3-2（10min）中间不出峰？

我估计在pH2.5死体积出的峰不是你要的，如果是你要的话，pH3时也绝对对出峰的。pH是可以改变出峰时间，但是对时间的改变比较小，溶剂梯度才是改变出峰时间的主要因素。

你的实验有问题，缓冲液从2.5～3.0改变这么大，有点不太可能！请将具体的条件列出来，大家好帮你分析！一般梯度从5%～95%（有机溶剂），梯度时间20min即可。确认所有的峰都要出来，然后根据出峰时间确定起始和最终有机相的比例！

呵呵，死时间出的峰是我想要的，因为我进的是标准品。ph3就是不出峰啊，你为什么这么肯定呢？我走梯度，不行啊，不知道为什么。

缓冲液从2.5～3.0改变这么大，为什么不可能啊？我走的是线性梯度，mp：A1:磷酸氢二钠（10mM,pH=3),A2:磷酸氢二钠（10mM, pH=2) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40.大家看看有什么不妥吗？

分离一个化合物无须梯度这么麻烦，等度就可以了
你的化合物是酸性的吗，用的是什么柱子？
要是酸性化合物，一般RP柱，你的方法就是有问题的，酸性化合物在pH越低的条件下电离就越弱，疏水性就越强，这样一来保留越强才对。
最好告知你的化合物性质或结构和柱子类型，否则都是瞎建议

呵呵，两个月都没分出来，哪有你说的那么简单，不是我的方法有问题，是样品太复杂，奇怪的现象连连发生，你说的不可能它就发生了啊，我分离的目标是多肽盐，柱子就是c18柱。看看有什么好的建议不？

我也没有跑过pH梯度，不知你是怎样做到的！难道是用一定浓度的三氟乙酸溶液跟流动相跑的？pH变化只有0.5，这也太难控制了吧！
不过pH对结果的影响有时确实很大，我就遇到过一样品中性条件下不成峰型（整个一基线抬高），加0.1%三氟乙酸峰就很漂亮。还有做手性分析时0.1%三氟乙酸一点分不开，但在此基础上加0.02%的二乙胺对应体就基本彻底分离，而只加二乙胺也是一点分不开。

我想现在首先应该弄清楚pH2.5时死时间出的那个峰到底是不是样品峰，可进一空白对比看看。

PH2.5时完全离子化，所以基本不保留，随着流动相直接洗脱。PH3时可能洗脱不下来，所以你试一下加大有机相的量。
建议用PH3不用什么PH梯度，然后加大乙腈的浓度。试验一下，看结果如何？

[ 本帖最后由 chrispand 于 2009-7-22 16:54 编辑 ]

原贴问题：
我想走一个pH梯度，在pH3时，不出峰，在pH2.5时死时间出峰，为什么走线性梯度pH3-2（10min）中间不出峰？
补充问题：
缓冲液从2.5～3.0改变这么大，为什么不可能啊？我走的是线性梯度，mp：A1:磷酸氢二钠（10mM,pH=3),A2:磷酸氢二钠（10mM, pH=2) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40.大家看看有什么不妥吗？

我的回答：
这可是一个高难度问题，请大家不要以为很简单。pH梯度做的人比较少，也容易被忽视。
其实pH梯度比浓度梯度复杂得多同。学问很大。不是一般的知识和操作所能了解和掌控的。
在这里也不可能简单二三下就能说清楚。估计真正能说清的人国内也没几人。即便是色谱大师或一些所谓牛人，也是一头雾水。

我所关心的是你所说的pH梯度。你如何能准确控制或测定流动相的pH?其实原因的解释是次要的。结果才是主要的。
另外，被测多肽中有什么碱性氨基酸组成？
我关心此问题。 液色迷人 http://hplc2.blog.163.com