【求助】我怎么这么笨老是养不好这个细胞？

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标题:【求助】我怎么这么笨老是养不好这个细胞？

DNA[使用道具]
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发表于 2012-10-14 11:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大哥大姐，你们好。我怎么这么笨呢？谁能帮帮我。以下是我的操作步骤。
复苏
1．从液氮容器中取出冻存管，迅速投入37℃—40℃蒸馏水中，不断晃动使其迅速融化。
2． 1000rpm离心5min，吸除冻存液，加入1ml无血清培养液，轻柔吹打形成悬液。
3． 1000rpm离心5min，吸除培养液，加入1ml含血清培养液，轻柔吹打形成悬液，移入25cm2培养瓶中，加含血清培养液到5ml。
4． 37℃，5%CO2培养箱中培养。

传代
1．倒掉培养瓶内旧培养液，用无血清培养液洗1次。
2．加入0.25﹪Trypsin溶液（25ml培养瓶1ml，75ml培养瓶3ml）轻轻晃动一会，倒掉。再加入0.25﹪Trypsin溶液（25ml培养瓶1ml，75ml培养瓶2ml），置于37%培养箱温育1min。
3．镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大迅速加入含血清培养液终止消化。
4．轻柔吹打瓶底细胞脱落，并吹打形成单细胞悬液。
5．计数
6．以合适比例（1:3或者1:4）接种于新培养瓶中。
7． 37℃，5%CO2培养箱中培养。

以上是我的操作步骤，我用的是GIBCO的1640，HYCLONE的HS，四季青的FBS，CORNING的培养瓶。有位老兄让我换成只用FBS的1640培养液，而且是进口的FBS。我已经配好了好多培养液，感觉有点可惜，大伙的意见呢？有哪位用过国产的FBS吗？还有人说不用HS,PC12会出现分化的，是不是呢？

已经复苏了好几次了，就是不长，也不死。只有一次，因为显微镜坏了，好几天没看他，就长了，结果传代后又不长了。是不是和我；老去动它有关系呢

总是和别人要细胞种，已经很不好意思了。却又总是养不活，现在我不仅难受，而且快对自己失去信心了。大伙来帮帮我吧？！

831226[使用道具]
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发表于 2012-10-14 11:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

复苏的时候动作要快，从液氮容器中取出冻存管，迅速投入37℃—40℃蒸馏水中，不断晃动使其迅速融化。把含细胞的冻存液直接加入已经放好20-30ml 含FBS的完全培养基中，（冻存液中的DMSO在常温下对细胞有损伤作用)然后再离心，再洗一次，再加到培养瓶中培养，细胞应该计数，接种密度10的5次方/平方厘米。
另外也可能是冻存的技术不过关。
血清一般用Hyclone或GIBCO的比较好

DNA[使用道具]
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发表于 2012-10-14 11:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

别人也是直接离心的，养的好好的。也可能是冻存技术的问题。今天我又和另外一个人要了一管，重新复苏了。不知道这次怎样？

难道问题就是出在血清上吗？我是不是该换血清呢？但是也有文献报道说是用的国产的小牛血清养好这种细胞的呀。是血清的问题吗？

jujuba[使用道具]
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发表于 2012-10-14 11:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你养的是什么细胞？血清有灭活吗？我们也是用的国产血清+1640，挺好用的，细胞冻之前的状态及是否过于老化也很重要，至于复苏技术主要是速溶，应该问题不大，你可以试着先不离心去冻存液，直接加血清和培养液，12到24小时后再换液离心，细胞一天看一次就差不多了，你经常动它也会有影响，祝你实验顺利！

biabiade[使用道具]
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发表于 2012-10-14 11:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你做的是什么细胞？我认为从你的描述上客观原因不太可能。也就是说血清和培养基的问题都不大（如果你的细胞不是特别娇贵），因为别人已经培养成功了。我建议你：1 可以问问做同种细胞的同事或同学，看看他们对你这种细胞有什么特别的经验。2 从自己的操作上找问题。比如：（1）冻存时的降温程序较快；（2）复苏时，动作要快。刚复苏时细胞接种密度不易小，因为许多细胞会死亡。同时，血清浓度也不易太小，待贴壁后再降低浓度。（3）传代消化时间不易过长，因为这对细胞伤害也很大。
我传代时一般好象也没你做的这么细。我操作的基本过程中没有用无血清培养基，不知道你这样做有没有必要。另外，给你举个我的例子，不知道有没有启发和帮助。我刚开始培养细胞，有一次细胞奇怪的全部死亡，同样也找不出问题。后来，找我们一个师兄看着我做，才发现是因为我每次都将吸完培养基的试管在火焰灼烧消毒，导致培养基中的蛋白质变性而产生有毒物质，致使细胞死亡。
我现在很理解你的心情，别灰心，万事开头难。谁都是这样一步步走过来的。祝你成功！

DNA[使用道具]
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发表于 2012-10-14 11:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一着急忘了说是什么细胞了，我养的是PC12细胞

DNA[使用道具]
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发表于 2012-10-14 11:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

血清都灭活了的，而且是在加到培养基里以后才一起过滤的。

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发表于 2012-10-14 11:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实，血清在过滤后加入完全可以。培养基的ph值对吗？一般过滤会使ph值下降。这也会影响细胞生长。pc12我没做过，建议你搜索一下，会发现许多东东。这也是斑竹教的，呵呵。

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发表于 2012-10-14 11:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得问题应该不是出在培养液上.你可以请教一下给你细胞的同学,看这株细胞的培养由什么特殊之处;其次我觉得复苏这一步十分重要,不必用无血清培养基洗,使细胞免一次离心,你说得细胞不活也不死不知什么意思,我以前碰到过这种情况,就先不要动他,给细胞一个喘息得机会;你的血清多大浓度,10%吗;传代消化不要过,以免影响细胞黏附能力;祝你成功!

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发表于 2012-10-14 11:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的的培养液是百分之十的HS和百分之五的FBS.

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