【求助】求教细胞培养！！

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标题:【求助】求教细胞培养！！

麦丽素1986[使用道具]
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发表于 2012-10-17 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有哪位同盟养鼻咽癌CNE-2细胞的吗？我刚养这株细胞，只有点心得体会，希望大家能指点迷津。
1、比较好生长，贴壁牢固，很适合做细胞爬片等实验，不容易脱片。
2、由于它贴壁牢固，所以用胰酶很难消化，造成吹打时很费时和费劲，细胞残留在旧瓶，我曾用PBS洗后，用胰酶洗，再加胰酶，放在37度温箱消化，都要10分钟才把它消化下来，而且有部分细胞已经消化过度漂起来了，有部分还没变形，很恼人，最后送细胞做流式时，老师说我的细胞消化过度粘在一起，很难过那个小孔，其实我当时还感觉有很多细胞没消化下来，残留在旧瓶里，可惜得要死，如果细胞加药或受到照射、营养不良时就更难消化。
哪位高手给我一些指导啊！有什么方法让细胞消化快点，吹打比较容易，而有不损伤细胞？还有，如果用250ml的玻璃瓶养此细胞，让它刚好长3天，一般开始是接种多少细胞呢？5×10的5次方－这个细胞数合理吗？

fklo83[使用道具]
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发表于 2012-10-17 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同EDTA一起消化。细胞生长速度同接种细胞量和牛血清的量都有关系，你可以5.10的5次方，不同血清浓度做个预实验看看。

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-10-17 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在也在养.刚开始时,消化也是掌握不好,现在刚刚有点感觉.
消化的难易程度与细胞的数量有关.一般是隔日传代的.久了细胞老化后消化旧很麻烦了.
另外,前一次消化的不好,细胞酒会不均匀,跟难消化.我的观点是换掉这个培养瓶.
问一下.你消化不用EDTA吗?

麦丽素1986[使用道具]
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发表于 2012-10-17 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在也在养.刚开始时,消化也是掌握不好,现在刚刚有点感觉.
消化的难易程度与细胞的数量有关.一般是隔日传代的.久了细胞老化后消化旧很麻烦了.
另外,前一次消化的不好,细胞酒会不均匀,跟难消化.我的观点是换掉这个培养瓶.
问一下.你消化不用EDTA吗???

——————————————————————————————————————————————————————————————

谢谢以上二位赐教！我的胰酶有EDTA的!别人用都很好，同实验室的另一同学用我的胰酶消化CNE-1，只需要1分钟就可以了。真郁闷！其实我也经常换瓶，感觉这样确实好点！但还是没有质的飞跃！我的实验有7个剂量点，5个时刻点，我现在担心的是，在某一时刻点收细胞脱的时间太长，影响实验的客观性！平时收细胞长点倒无所谓！

麦丽素1986[使用道具]
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发表于 2012-10-17 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 viviwang1987 于 2012-10-17 15:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我现在也在养.刚开始时,消化也是掌握不好,现在刚刚有点感觉.
消化的难易程度与细胞的数量有关.一般是隔日传代的.久了细胞老化后消化旧很麻烦了.
另外,前一次消化的不好,细胞酒会不均匀,跟难消化.我的观点是换掉这个 ...

你也在养此细胞,咱们多多交流哦：），你平时是隔天传代吗？据说传得太勤，那对细胞不好，我的实验要控制细胞长3天，所以我正在摸这个生长速度，你平时一般是1/3传，还是1/4传呢？

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-10-17 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那你传得很密哦！我有时1/5传，三天就满了，你岂不是天天传或隔天传？我们实验室人说，这样传得太密对细胞生长不太好。因为每次传代都要给一定的时间给它适应。我现在做细胞放射后的凋亡实验，我用的剂量0～8Gy，可是发现每次实验种相同的细胞数，经不同剂量照射后，在同一时刻点收细胞，0的细胞非常多，长满瓶，甚至挤的有点营养不良，8的细胞少的可怜，加上细胞难消化下来，很难收得到！我正打算用浓度梯度的方法来种细胞，就是，8的种多点，以一个浓度递减，到0就少点，到时在同一时刻点收细胞，那各个剂量的细胞量就差不多了，你觉得这样设计合理吗？剂量不同，初始细胞数不同，最后会影响凋亡的结果吗？

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发表于 2012-10-17 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们这里一直是这样呀!!!
高剂量点种的多,底剂量种的少.
我的细胞隔日传代,长的很好.相反,如果细胞数太少.细胞反而长不起来.
急呀!用人家的放射原,不好搞关系,,还经常被拖延!!!

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-10-17 15:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

唉，看来咱们真的是同病相怜啊！我也是在别的实验室做细胞培养和放射实验。其实做实验是一方面，做人也是一方面，其中的微秒之处可能只有过来人才明白！我也急啊，急着想去做医检，可是实验又放不了手，不知道何时是到头，哪里是岸！你是病理专业的，怎么做放射实验呢？你医检完成啦？
还是言归正传吧！高剂量的细胞数多，低剂量的细胞数少，那样可以保证他们的可比性吗？那如果同一剂量，一瓶细胞密度大，一瓶细胞密度少，你能保证这两瓶细胞接受的都是同一剂量吗？
你们那做细胞放射后的凋亡吗？用流式细胞仪？我看到很多加药的实验都是设几个浓度，每个浓度种相同的细胞数，但加不同浓度的药，在设几个时间点收细胞，上流式就得了。我做集落形成时是用浓度梯度稀释法来做，但不知道凋亡是否可以，你们那做凋亡也按浓度梯度稀释吗?
我已经在qq上加了你，看来咱们真的很有缘分！我已经给你e-mail了！希望咱们多多交流！

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发表于 2012-10-17 15:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请用胰酶-EDTA，或胰酶-EGTA消化，细胞团可以成为单个细胞，便于传代计数及FACS，另外，上FACS时应先过筛，以免堵赛

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-10-17 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请用胰酶-EDTA，或胰酶-EGTA消化，细胞团可以成为单个细胞，便于传代计数及FACS，另外，上FACS时应先过筛，以免堵赛

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EGTA?那是什么？我的胰酶里有EDTA，现在我把胰酶分装成约5ml于西林瓶中，－20度冻存，每次拿一小瓶出来解冻消化，效果稍微好点，还是没有质的飞跃，一般都要10分钟，如果用一次性培养瓶可能还要15分钟，最可恼人的是细胞消化不同步，有些已经漂起来了，一些还没变形，不知是否中止消化，有时搞到传代后死细胞特别多，可是实质上有很大一部分细胞还没消化下来。唉，郁闷！

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