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标题:【求助】求助版主！各位大侠！

mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-10-18 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】求助版主！各位大侠！


我养的是视网膜神经细胞。想做免疫组化。我已将盖玻片裁成小块，泡酸处理，又经高压，放到24孔板里。也涂多聚赖氨酸了。为什么细胞不往上爬呢？是哪里出的问题？细胞都集中到玻片外，而且不太爱贴壁。急切需要指导。谢谢！
我的原代过程如下：
1.取材后置于DMEM培养液中.
2.吹打,离心,1200转,3分.
3.弃上清,PBS吹打,再离心.
4.0.25%胰酶消化,37度,3--5分.
5.终止消化,离心.
6.再加培养液重悬,接种到新的已涂多聚赖氨酸的培养瓶里.
我用的培养液是Hyclone的液体DMEM/F12 1:1,加的10%的GIBCO的FBS
我觉得条件应该差不多了,可细胞就是不爱贴壁.我已是毫无办法了.求教哪位有此方面经验的大侠,主任帮忙想想问题出在什么地方,我该怎么改进?
谢谢了先!
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园丁##[使用道具]
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发表于 2012-10-18 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有以下可能：

1。多聚赖氨酸浓度稀了，可以用100ug/ml甚至更浓（最后用水洗干净）

2。波片质量问题！

3。可以增加接种细胞的密度！
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2012-10-18 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢主任!
多聚赖氨酸我配的是 100ug/ml,而且以前也用过的玻片,也长过细胞,可就是不知道现在为何不长!
我接种的密度大约为2x10^6.
另外,我的细胞总是聚团,怎么办?这样会影响细胞的活性吗?
我接下去做了几次流式测凋亡指数.取的是3天的贴壁细胞.显微镜下看细胞还都可以.但结果显示死亡的占多数,这是怎么回事?我实在不知该怎么往下进行了.
谁快来救救我吧!
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glass[使用道具]
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发表于 2012-10-18 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问问主任,我的原代过程应该不会有太大问题吧?
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园丁##[使用道具]
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发表于 2012-10-18 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢主任!
多聚赖氨酸我配的是 100ug/ml,而且以前也用过的玻片,也长过细胞,可就是不知道现在为何不长!
我接种的密度大约为2x10^6.
另外,我的细胞总是聚团,怎么办?这样会影响细胞的活性吗?
我接下去做了几次流式测凋亡指数.取的是3天的贴壁细胞.显微镜下看细胞还都可以.但结果显示死亡的占多数,这是怎么回事?我实在不知该怎么往下进行了.
谁快来救救我吧!

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我认为你目前应该作的是：
1。调整好细胞的生长状态，摸清他基本特性，这是基础。
2。细胞聚团是原代中的一个常见问题，应该注意：要用筛网；吹打要充分（如果在计数时看到有细胞团，就应该继续吹打）

不知道您是用什么方法诱导调亡？？
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ffooll[使用道具]
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发表于 2012-10-18 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的细胞成团应该是由于多聚赖氨酸浓度太低或质量有问题，建议重配0.1mg/ml的多聚，神经元在国产的波片上是很难生长的，即使是处理过的，我们实验室一直用fisher的coverslip，长的很好，但国产的就是长不好，但中科院神经所他们用的却很好，很奇怪，你可以试试多赖泡得时间长一点，或者事先在板上养一些胶质细胞，然后种神经元，拙见拙见。
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发表于 2012-10-18 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的细胞成团应该是由于多聚赖氨酸浓度太低或质量有问题，建议重配0.1mg/ml的多聚，神经元在国产的波片上是很难生长的，即使是处理过的，我们实验室一直用fisher的coverslip，长的很好，但国产的就是长不好，但中科院神经所他们用的却很好，很奇怪，你可以试试多赖泡得时间长一点，或者事先在板上养一些胶质细胞，然后种神经元，拙见拙见。

————————————————————————————————————————————————

不同来源的波片对神经元生长的影响的确很大！

请问， 您那里的fisher的coverslip是从什么地方买的？如果可以的话我想年后买一些！
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-10-18 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位的指点，我会按照大家的建议再试试，我也想问一句， 您那里的fisher的coverslip是从什么地方买的？
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ffooll[使用道具]
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发表于 2012-10-18 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用过fisher的载玻片（分好多等级），但时间长了也不行，记得年初做胚胎小体免疫荧光时总脱片，后来发现是载玻片过期了，更换后解决。
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