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标题:【求助】请教悬浮细胞原位杂交合荧光标记检测凋亡的经验

mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-10-22 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教悬浮细胞原位杂交合荧光标记检测凋亡的经验


请教悬浮细胞原位杂交合荧光标记检测凋亡的经验：哪位老师同学养过悬浮细胞的？我现在想拿这些悬浮的细胞检测其凋亡情况和做原位杂交，不知道细胞如何贴到载波片上，应该用何固定液固定？固定后如何保存？请为我指点指点吧，不胜感激！
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tieshazhang[使用道具]
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发表于 2012-10-22 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用Cytospin甩到载玻片上。固定用甲醇、乙醇、paraformaldehy都可以，要根据具体实验而定的。
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发表于 2012-10-22 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tieshazhang 于 2012-10-22 12:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用Cytospin甩到载玻片上。固定用甲醇、乙醇、paraformaldehy都可以，要根据具体实验而定的。

谢谢你的回答：）！
我的细胞是加了一种新药，不同的剂量，想看药物诱导细胞凋亡的情况，用cytospin时每组细胞要求甩的细胞数一样吗？因为我收的时候，发现对照组的细胞很多，最大加药组的细胞少得很，如果用同样得体积，可能对照组的细胞重叠了，而加药组的确很稀疏。所以甩细胞时要准确计数吗？我的问题很低级，麻烦你解答了！
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发表于 2012-10-22 12:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
共同讨论，不必那么谦虚。

用cytospin时每样品的细胞数最好大致一样，不然照相时细胞少的那个样品就很难找到好视野。太多细胞重叠也不行。我印象里是10^4-10^5个,不过不很肯定，你做个试验看看镜检结果就知道了。既然是大致，就不必准确计数。
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发表于 2012-10-22 12:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那这样的话，将来片子还用于统计吗？我看到有些文献上说在对阳性部位进行分级，<25%为阴性，25%~50%（＋）>50％（＋＋）等，那如果不精确计数，甩的细胞数目不一致，怎么有可比性呢？
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发表于 2012-10-22 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2012-10-22 12:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那这样的话，将来片子还用于统计吗？我看到有些文献上说在对阳性部位进行分级，50％（＋＋）等，那如果不精确计数，甩的细胞数目不一致，怎么有可比性呢？ ...

凋亡%可比
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发表于 2012-10-22 12:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你意思是说，用流式细胞仪检测凋亡率来比较，甩片只是为了获得形态学的标记，不用比较凋亡率吗？
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发表于 2012-10-22 12:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不是。镜检可以同时获得形态和凋亡率的数据(虽然数起来辛苦)，因为不管你甩多少细胞上去，其中的凋亡细胞占总体细胞中的%是固定的，因此用CYTOSPIN时细胞计数不很准确也不要紧，应为%固定。甩细胞时计数不必准确不等于镜检计算凋亡细胞%时计数不必准确。后者尽量准确为好。
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发表于 2012-10-22 12:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
oh，i see！：）
再请教一下，我想做荧光标记凋亡和细胞的原位杂交，但现在还没选好试剂，可能会用promege的tunel，原位杂交也没想好要检测rna或dna，只是想甩片后固定，将细胞保存在－80度，做这两项内容的细胞都可以用4％的多聚甲醛在4度固定30分钟就行了？听说做rna的原位杂交固定用的多聚甲醛要用DEPC水来配，又相关经验提供吗？
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tieshazhang[使用道具]
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发表于 2012-10-22 12:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
言归正传，我没试过先保存一段时间然后再做的方法。一般固定后就直接做了。普通的用-20度甲醇或乙醇固定2-16小时，需要用多聚甲醛的话，可以在甲醇或乙醇固定后再进行。

做rna的原位杂交固定用的多聚甲醛要用DEPC水来配的说法我没听说过，希望你做了以后和大家分享成功经验。
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