细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】G418筛选后鉴定

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 14  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】G418筛选后鉴定

bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
1

发表于 2012-10-22 13:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】G418筛选后鉴定


我用pEGFPC3质粒转染HepG2细胞，筛选后出现抗性克隆，但是遗憾的是没有绿色荧光（而此时阴性对照细胞已经全部死亡）。实在没办法，我想抽提基因组DNA并用PCR法鉴定我的阳性克隆，不知可行否？
急死了，还请大侠指点，谢谢！
顶部
wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
2

发表于 2012-10-22 13:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
完全可行。我刚刚用这种方法鉴定过。加油吧！祝你好运！
顶部
bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
3

发表于 2012-10-22 13:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，再请教：您用的是带绿色荧光的载体吗？按道理我的阳性克隆应该发绿色荧光的呀，现在虽然有克隆出现，但是没有荧光，所以我现在也不知有没有PCR鉴定的必要？
谢谢！
顶部
greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
4

发表于 2012-10-22 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

G418阳性克隆不一定就是GFP阳性克隆呀！我做过类似的实验，G418阳性克隆中大概有一半是GFP克隆。如果你的克隆没有发绿色荧光，也需要做一下PCR鉴定，看看基因组中是否有GFP的DNA插入。如果有。是否是GFP阅读框或启动子的问题让GFP基因不能表达？如果没有。那就可能是你的转染或载体的问题了。

我不知道你的GFP和NEO基因在载体上是怎么排列的。是用两个启动子还是一个启动子基因中间插入一个核糖体内部进入位点或是融合基因，或是两个载体共转染。所以，你还需要考虑一下这些问题。以保证GFP能确实表达。
顶部
bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
5

发表于 2012-10-22 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是pcDNA3，不带GFP。G418筛选了大约两星期，然后以维持量继续培养了几天，待细胞形态较好时就可鉴定了。同意biotin的意见，有必要做PCR鉴定。
顶部
lixi559[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73492
精华 0
积分 560
帖子 820
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-23
状态 离线
6

发表于 2012-10-22 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的你好。我也是用pcDNA3，转染人成纤维细胞。但我不知道用什么筛选？你根据什么确定用G418筛选？你的是瞬时还是稳定表达？怎么确定的？请多多指教，多谢。
顶部
bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
7

发表于 2012-10-22 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，再请教：我用的Effectene或Fugene6转染HepG2细胞，转染后24-48小时观察有部分细胞发出绿色荧光，转染后48小时将细胞以1：10（面积比）传代至培养瓶中，置培养箱过夜待细胞贴壁后加入G418筛选，以500ug/ml筛选6天，第五天细胞开始大量死亡，第6天开始以250ug/ml维持筛选，大约第10天出现阳性克隆而阴性对照细胞全部死亡。然而遗憾的是阳性克隆却没有荧光，按道理瞬时转染有荧光筛选后荧光应该更多才对呀。因为我用的是pEGFPC3载体（载体本身即含有GFP标记），所以应该不存在“GFP阅读框或启动子的问题让GFP基因不能表达”的情况呀。
还请指点，谢谢！
顶部
one[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73393
精华 0
积分 697
帖子 1114
信誉分 100
可用分 6353
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
8

发表于 2012-10-22 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
按道理瞬时转染有荧光筛选后荧光应该更多才对呀。.....这是什么道理？

瞬时表达有荧光只表示GFP基因在胞浆中表达，这些GFP不一定进入了细胞的基因组。就并不能表示筛选后荧光更多。如果筛选后的细胞发荧光，说明GFP的DNA进入了细胞的基因组。
所以，瞬间表达和持续表达的原理是不一样的。
你再想想，也许还需要PCR鉴定细胞基因组中是否有GFP的DNA。
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
9

发表于 2012-10-22 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Neo基因啊。瞬时表达。
顶部
bluelake[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76389
精华 0
积分 382
帖子 444
信誉分 100
可用分 3046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
10

发表于 2012-10-22 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天去请教同学，他说pEGFPC3载体不太适用于稳定转染而建议我换pCDNA3.1。。。晕倒，偶都忙了那么多啦，现在换载体？
他还建议直接做WESTERN检测目的基因的表达，但我觉得western 比PCR要烦很多，是不是可以先只作PCR粗鉴定一下啊？
还有单克隆化是不是一定也要做啊？
菜鸟问题，还请不吝指教！
顶部
 14  1/2 12››