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标题:【求助】多质粒共转染（瞬时）加受试物测试

dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】多质粒共转染（瞬时）加受试物测试

小弟准备作一个多质粒共转染（瞬时）加受试物测试荧光素检测，因为没做过，都是看文献看的，文献上的说法也不一致，有几个问题想问问大家：
1、瞬转细胞到底是在培养板里作好还是在培养皿里作好？如果用6cm的dish作，转好的细胞可以再接种到培养板中给药吗？
2、瞬转在什么时候作比较好？
3、多个质粒作转染，比例如何控制？质粒与转染剂的比例呢？
4、转后多长时间给药为宜？
哈，一口气提了好多问题，有经验的TX赐教啊，哈哈
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家看看哦，还有一个问题，细胞用1640养的，转染剂说明书上说用DMEM溶，那能不能用1640溶转染剂？是不是最好细胞用什么养的，就用什么溶？
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好细胞用什么养的，就用什么溶。
多个质粒作转染，合适的比例必须进行量效关系检测才能作出选择。
瞬转在细胞对数增殖期作比较好。
在培养板、培养皿里作瞬转细胞差不多，
用6cm的dish作，转好的细胞可以再接种到培养板中给药。
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831226[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你转染前的质粒怎么制备的？瞬时转染用什么方法？磷酸钙还是脂质体？
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bs4665[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 转染时24孔板、6孔板、培养瓶中均可，关键是你要多少细胞，如果你要的细胞数24孔板即可满足，就没必要用大的，浪费试剂。
2 顺转什么做都可以，就是要算好时间，不要大半夜的来加你的刺激剂。
3 多质粒共转染你要模一个最佳的比例，要做预实验的。
4 转染后多长时间给要最好查查文献，如果没有文献，也要做几个时间点去摸索，我加细胞因子是转染24h后加，PMA是检测荧光素酶的前4h加。

祝你好运
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flower-201[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在做多质粒瞬时转染，请问下各位，怎样才算多质粒的一个最佳比例呢？
这个最佳比例根据什么来确定啊？

谢谢，呵呵。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #6 flower-201 的帖子

这个比例1 要看文献， 2 要做预实验
例如我转了4个质粒，一个是报告基因载体，另外三个是表达载体，如果DNA的总量是1微克，那你要设计如何转你的报告基因是最优化的，我的实验最后采用的是0.5微克报告基因载体，其余三个载体按1：1：1的比例混合，三个表达载体总量是0.5微克。实验证明效果不错。
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你转染前的质粒怎么制备的？瞬时转染用什么方法？磷酸钙还是脂质体？

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用质粒大抽试剂盒作的啊，我用的是华舜公司的。转染准备用脂质体作，阳离子聚合物那种
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个比例1 要看文献， 2 要做预实验
例如我转了4个质粒，一个是报告基因载体，另外三个是表达载体，如果DNA的总量是1微克，那你要设计如何转你的报告基因是最优化的，我的实验最后采用的是0.5微克报告基因载体，其余三个载体按1：1：1的比例混合，三个表达载体总量是0.5微克。实验证明效果不错。

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偶也是要转3个质粒，我的感觉是报告基因质粒的量相对要大，具体数据还要摸，因实验和细胞而异吧。大天使说说预实验的时候比例怎么设的吧？加内对照了吗？
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bs4665[使用道具]
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发表于 2012-10-23 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做预实验的时候没加内参照，转染的比例是1：1 1：2 等不同比例混合后，检测后确定了最佳合适比例。你可能要自己试试。请问你转的是转录因子吗？如果是可否告知是什么转录因子。谢谢
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