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标题:【求助】关于大脑皮层神经元的培养

王蜜蜜[使用道具]
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发表于 2012-10-30 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于大脑皮层神经元的培养

各位高手，如何让培养的细胞均匀分散啊？我的细胞不是聚集就是分散很远，怎么办啊？
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-10-30 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
注意应该使用含EDTA的消化液，因为钙镁离子能够促进细胞黏附，同时加入1－4mg/ml的BSA，主要起隔离作用。另外，细胞消化不完全和消化过渡都会产生细胞成团，消化过渡与细胞内RNA、DNA释放以及剪切力有关。
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园丁##[使用道具]
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发表于 2012-10-30 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的意见很对呀!

可否将您在皮层神经元培养时的消化方法作一个较详细的介绍?

谢谢!
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王蜜蜜[使用道具]
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发表于 2012-10-30 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是0.25%的胰酶消化。
具体是这样的：胎鼠取脑后剪碎，弃上清，加胰酶，在CO2孵箱中消化15分钟，每隔5分钟拿出吹打，然后钢网过滤。最后消化的几乎没有什么组织块了啊！细胞长的有很多是成团的，胞体聚集在一起，突起向外伸展，象刺猬一样！很难看！有的因为细胞太分散而无法连接，不爱成活。
最大的问题就是密度不均，真的要请各位多多帮忙啊！这个问题已经困扰偶好久了！大家多帮忙啊！小女子在这里先谢谢了！
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发表于 2012-10-30 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外消化过度和消化不完全怎么看啊？有没有什么可以观察的标准啊？
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园丁##[使用道具]
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发表于 2012-10-30 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是0.25%的胰酶消化。
具体是这样的：胎鼠取脑后剪碎，弃上清，加胰酶，在CO2孵箱中消化15分钟，每隔5分钟拿出吹打，然后钢网过滤。最后消化的几乎没有什么组织块了啊！细胞长的有很多是成团的，胞体聚集在一起，突起向外伸展，象刺猬一样！很难看！有的因为细胞太分散而无法连接，不爱成活。
最大的问题就是密度不均，真的要请各位多多帮忙啊！这个问题已经困扰偶好久了！大家多帮忙啊！小女子在这里先谢谢了！

——————————————————————————————————————————

200目筛网过滤，

增加吹打次数，（吹打力度均匀，不要过猛。注意要把组织碎片都吸到管子里。）
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2012-10-30 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家帮忙，看来很多问题只有靠自己的摸索了，没有什么定律的！
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nn255[使用道具]
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发表于 2012-10-30 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的问题可能与多聚赖氨酸的铺板有关系，如果没有干或者积存太多，都有可能发生。还有我消化皮层时，是0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化37度30min，然后终止消化，缓慢吹打。细胞长的很好啊。
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王蜜蜜[使用道具]
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发表于 2012-10-30 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上，这个问题我真没有注意到，积存多的地方细胞就会聚集吗？你通常是培养之前什么时间铺板？然后怎么处理？我是提前二天铺，24小时后吸出，然后第二天培养，接种之前不再冲洗了。
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王蜜蜜[使用道具]
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发表于 2012-10-30 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

已经贴壁的神经元细胞存活到第十天，用DMEM冲洗4遍（实验需要），细胞会丢失吗？
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