【求助】不是说Annexin V-FITC是检测凋亡的金标准吗？

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标题:【求助】不是说Annexin V-FITC是检测凋亡的金标准吗？

eric930[使用道具]
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发表于 2012-11-2 12:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有哪位做过流式Annexin V-FITC检测凋亡的高手能给指点一下迷津？压力太大我真要疯了！
我原本是要做去甲肾上腺素诱导凋亡的，用Annexin V-FITC来检测，可是不论用到多大量的去甲，心肌细胞看起来仍是活蹦乱跳的，Annexin V-FITC也做不出结果。这是国外文献有做不少的，然而我做不出来。写信去请教，也一直没回音。真怕会要下岗了，不过就是主任不下我的岗我也觉得无颜见人，哪位同胞能帮帮忙，救救我！
我是这么做的：
原代培养的心肌细胞（约500000个细胞/孔，12孔板）状态良好后低血清（1％FBS)培养24h,加入去甲肾上腺素，再培养24h，然后按说明书操作在流式细胞仪检测细胞凋亡率。看人家写的很简单，可是把去甲的浓度都加多
100倍了，也得不到阳性结果！我不知道到底哪里错了，是最后Annexin V-FITC的操作有错？还是去甲用的不对？还是加的方法不对？总不会是它本来就没这作用，人家老外都撒谎吧！？
不知道怎么办才好，周围也没有人可以问。各位教授老师、师兄师姐、丁香园友，请帮帮忙指点一下，我真是没辙了！

9900[使用道具]
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发表于 2012-11-2 12:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我没做过Annexin V-FITC染色的凋亡测定，但是我在用神经细胞造凋亡模型时有这样的体会，如果杂质细胞比例大，则很难造出损伤，而且细胞状态要好，才行。
实在不行，先用Hoechst染色观察一下是否有凋亡。

麦丽素1986[使用道具]
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发表于 2012-11-2 12:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我虽然没有做过Annexin V-FITC的凋亡检测,但做过其他方法的凋亡检测,感觉需要注意的是一样的,所以我认为你可以从以下几点考虑:
1,去甲是否对心肌细胞有用
2,做凋亡检测时,细胞应该用5%-10%的FBS,而不是1%的FBS,因为在低浓度的血清下,就算什么药都不加,细胞也长不好,这样阴性对照就做不出来了.
3,收集细胞时,应该将培养上清也收集,因为有凋亡的细胞漂起来了.
4,去甲最好买进口的
5,你提到"心肌细胞看起来仍是活蹦乱跳的",我不太明白,因为低血清下,原代培养的细胞48小时也能活蹦乱跳的,有点不可思意,你的细胞没有问题吗?

dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-11-2 12:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的阳性对照如何？这点很关键。

33号[使用道具]
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发表于 2012-11-2 12:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上说的对。曾买过clontech 的产品，结果一点荧光也没有，虽然最后得到全额退款，但损失的时间和其他损失却...

结论：首先要验证试剂是否正常。

eric930[使用道具]
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