【求助】心肌细胞到底要多长时间贴壁？

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标题:【求助】心肌细胞到底要多长时间贴壁？

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发表于 2012-11-2 12:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一叶[使用道具]
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发表于 2012-11-2 12:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

几个可能吧：
1.最主要的原因——消化的问题，一定是消化太过了，建议在此版块中搜索一下心肌细胞培养的消化过程；养心肌细胞消化是最关键的。你好歹得贴点成纤维细胞或者内皮细胞吧。你只需用胰酶就可，不用胶原酶(浪费money)，我用的浓度是0.06%(含EDTA)，建议采用进口液体包装的胰酶Gibco的(含EDTA)，250元/500ml，很好用的。先消化10min，弃胰酶，并用PBS冲洗一遍(以便有效清除血细胞和成纤维细胞及内皮细胞)；再继续消化，估计15只乳鼠(最好生后24小时内的)，需要消化3－4次，每次消化15min，采用水浴震荡100次/min。每次消化的胰酶取出后，加入等量的培养液(含10-20%的血清)中和，放置冰上，最后可以消化两次离心一次。建议实验过程中用上冰台，实验结果会漂亮一点的。另外，最后收集的细胞最好过一次筛网(100目左右的都可以)，以去除组织块。最后把细胞接种到培养瓶中，贴壁1.5小时后，取未贴壁的细胞，纯度就比较高了。接种到另外一个器皿中后，24-36h换液一次，即可进行实验了。
2.千万不要相信国产的血清，不是我崇洋媚外，实在国人太不争气了。用点进口的Hyclone的新生牛血清或者加强型小牛血清吧，大概是1.1元/ml，质量远胜国产胎牛，国产血清不说它能促进细胞增殖吧，光是那pH值和内毒素就够让人寒心的了。建议浓度15-20%。
好像该说的都说到了，有问题再说吧。
3.忘了告诉你贴壁时间，原则上24小时肯定贴了，还有一些可能贴得不太牢的。其实1.5h的时候，心肌细胞已经开始贴壁了，不信你可以把那几瓶去除杂细胞的培养瓶中的细胞继续养几天，就可以看到大量的成纤维细胞和内皮细胞中间有搏动的心肌细胞了。

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发表于 2012-11-2 12:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢！
1、我用的是1-2周的幼兔，为什么大家都用乳鼠，而不用乳兔？
2、为什么我消化下来的心肌细胞多数不是圆形，而是杆状？
3、DMEM的PH值是不是要很精确？要用酸度计测定吗？

我也觉得血清有问题，我这就准备买hyclone的胎牛血清！！不知道什么批号的好一些？
谢

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发表于 2012-11-2 12:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Hyclone 的胎牛血清真“黑”呀！！
500ml居然要3400RMB!!!
我就买新生牛血清吧！500ml 550元
不知道Hyclone的新生牛血清和四季青的胎牛血清相比，哪个要好一些？

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发表于 2012-11-2 13:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我养的心室肌与心房肌为什么一直不贴壁？
每次接种后多长时间都不贴壁，但也不是球形，而是杆状或梭形，镜下看活性也不是很好，这是为什么？请高手指点！谢！

消化步骤：
0.08%胰酶5min消化5min,0.025胶原酶II消化15min
重复4次，离心1000rpm,5min.消化时间接近2h,是不是消化时间过长？

培养基DMEM,血清不好，是北京元亨的，会不会是血清的原因？

郁闷中......

————————————————————————————————————————————————————————————————

你做的是成熟心肌细胞，而不是乳鼠心肌细胞，所以是杆状的细胞。这种细胞贴壁条件与乳鼠不同，消化条件也不同。就你所问的原因，其一是消化不能太过，其二，我认为也是主要原因是培养瓶或培养板需要涂多聚赖氨酸或者涂层粘蛋白等帮助贴壁，通常2~4小时就基本能贴壁。

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发表于 2012-11-2 13:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上兄提到的多聚赖氨酸或者层粘连蛋白不知道价格如何？并如何配制？

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发表于 2012-11-2 13:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我准备改良培养方法as following:
使用乳兔进行原代心肌细胞培养，并使用hyclone新生牛血清。
0.08%胰酶10min,消化4次，不再使用胶原酶（正好也用完了）
离心1000rpm, 5min,接种至一次性塑料培养瓶（含10%血清培养基预铺）。

还有两点疑问：
1.一定要10只以上的乳兔的心脏才能达到需要的细胞密度吗？
2.接种前一定要做细胞计数，调整细胞密度吗？

再谢

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小中大

你做的是成熟心肌细胞，而不是乳鼠心肌细胞，所以是杆状的细胞。这种细胞贴壁条件与乳鼠不同，消化条件也不同。就你所问的原因，其一是消化不能太过，其二，我认为也是主要原因是培养瓶或培养板需要涂多聚赖氨酸或者涂层粘蛋白等帮助贴壁，通常2~4小时就基本能贴壁。

——————————————————————————————————————

你说成熟心肌细胞是杆状的细胞，那么未成熟心肌细胞是什么形状？
消化下来时就与成熟心肌细胞不同吗？

nn255[使用道具]
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发表于 2012-11-2 13:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再提几个建议：
1.非得用兔子吗？其实常规都用大鼠的，心血管方面的实验还是用大鼠更为认可的；
2.纯化时，不一定非用塑料瓶，因为你真正接种的是纯化后的细胞悬液，这时用塑料瓶吧。
3.用1-2周的幼兔培养心肌细胞可能确实存活要差些，不能用早点的吗？比如出生后1-4天。
4.最好还是得10只左右吧，要不然太少容易消化过度的，可以参考《细胞实验指南》冷泉港实验室出的。
5.原则上，用的是塑料器皿不用包被也可以的，如果你实在是担心它不好好贴壁，那就包被些1%的明胶溶液吧，用PBS配，高压消毒，37度包被过夜。
6.你的胰酶最好也改进一下，不太建议用自己配的胰酶(加上EDTA)，尤其是初学者，因为自己配的胰酶效价不稳定，消化时不太容易掌握。
7.计数还是计一下吧，以后有经验了，就不用每次都计了。

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发表于 2012-11-2 13:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢过!可是我没有《细胞实验指南》（冷泉港实验室），可否传给我一本，不胜感激！我只有司徒镇强的《细胞培养》。
e-mail: zhanghao@fmmu.edu.cn