细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】关于细胞解冻和复苏的问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 16  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】关于细胞解冻和复苏的问题

bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
1

发表于 2012-11-5 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于细胞解冻和复苏的问题

大家好，我马上要做细胞培养，但先要把细胞解冻，我以前没做过这种工作，怕出错，想请问各位前辈标准的操作是怎样的？操作中有什么要注意的吗？如何才能保持细胞的活性？
我刚刚入实验室，请大家帮帮我！！
顶部
qhyu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77304
精华 0
积分 705
帖子 1049
信誉分 100
可用分 6111
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
2

发表于 2012-11-5 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞冻存与复苏最重要得一点是慢冻快融，这样才不会因为小冰晶导致细胞破裂。具体方法有很多，许多资料和书上详记了许多经典得方法，你可以根据自己的条件选择。
祝成功！
顶部
JK.jon[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75188
精华 1
积分 528
帖子 652
信誉分 102
可用分 4146
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3

发表于 2012-11-5 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
提醒你注意一下，细胞复苏是速度一定要快，尤其是在-5℃～０℃这阶段，因为在这个温度阶段细胞最容易受损，如果复苏的步骤正确，细胞仍然仍然可以生长，细胞活性损失也不是太大。
细胞复苏的步骤是：一、准备一个1,000ml的烧杯,放入大概三分之二的37℃的温水。
二、从液氮中取出冻存管，迅速放入温水中震荡，尽可能在短时间内使其中的物质融化。
三、将冻存管中的细胞悬液转移到离心管中，然后在1,000转/分钟离心10分钟，弃去上清液。
四、在细胞培养瓶中加入培养液，然后把细胞放入培养瓶中，放入37℃温箱中培养。经过以上步骤,如果没有什么特殊情况细胞是可以生长的。
GOOD LUCK！！
顶部
乌贼老弟[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74586
精华 0
积分 336
帖子 411
信誉分 100
可用分 2791
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
4

发表于 2012-11-5 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于冻存
(1)最好选择对数生长期的细胞用于冻存,在冻存前一天换一次培养液.
(2)用胰蛋白酶消化贴壁生长的细胞,离心并计数,去除胰蛋白酶及培养液,加入配制好的冻存液(10%DMSO或甘油),冻存液中细胞的终密度为5x106／ml-5x107／ml,封好冻存管.
(3)标准的冻存程序是降温速率-1__-2℃/分钟;当温度降到-25℃以下时,可增至
-5__-10℃/分钟;到-100℃时,可迅速浸入液氮中.要适当掌握降温的速度,总之,在开始降温时速度应小于-10℃/分钟.
细胞在液氮中储存时间理论上是无限的,,但很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次,观察细胞堆冻存的适应性.
祝你成功!
顶部
dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
5

发表于 2012-11-5 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以提高复苏细胞培养基得血清浓度，或者用高等级的血清来提高复苏效率
顶部
ROSE李[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76171
精华 0
积分 466
帖子 611
信誉分 100
可用分 3866
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2012-11-5 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞复苏后不用急着去除DMSO，解冻后直接加到培养瓶中，多加点培养基稀释，到第二天再换液即可，因为复苏后接着离心，对细胞造成的机械损伤较大，若是贴壁细胞可能会影响细胞贴壁。
经验，仅供参考！
顶部
ffooll[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73418
精华 0
积分 437
帖子 574
信誉分 100
可用分 3666
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
7

发表于 2012-11-5 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问细胞复苏后的存活率能达多少,我师兄们说很低,多半的死细胞.可书中又说能达百分之九十几.我现在都不敢直接冻存细胞了.
顶部
ffooll[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73418
精华 0
积分 437
帖子 574
信誉分 100
可用分 3666
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
8

发表于 2012-11-5 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外,细胞冻存后对细胞mRNA有多大影响.
顶部
DONT[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73548
精华 0
积分 449
帖子 557
信誉分 100
可用分 3626
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
9

发表于 2012-11-5 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

复苏后存活率一般能达到百分之九十几，大胆的去复苏吧，不动手做做，怎么知道行不行呢，难道你就只有一管细胞吗？不行就再复苏一
顶部
sunnyB[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77335
精华 0
积分 581
帖子 862
信誉分 100
可用分 5059
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
10

发表于 2012-11-5 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室条件限制 所以我复苏细胞没有很严格的条件 只是做到尽量快 细胞状态也挺好的 我没用的冻存液是进口的一种 对细胞损伤小
顶部
 16  1/2 12››