【求助】神经干细胞培养失败N次----SOS

细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】神经干细胞培养失败N次----SOS

12 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】神经干细胞培养失败N次----SOS

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-11-7 15:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

三个月前，我们培养神经干细胞一直很成功，但从7月份起，我们始终无法再培养成功！症状如下：1、取材步骤同以前，接种后观察，绝大多数是折光性强的单细胞，死细胞和组织块极少；2、第二天发现培养瓶中几乎全部细胞都悬浮，并被一种粘稠的物质粘成一长索状，肉眼观似鼻涕，镜下见大量细胞死亡，形成碎屑！3、这种情况日渐加重，4-5天后，绝大多数细胞已死亡；4、虽然偶尔也可形成一两个神经球，但状态极差，不能贴壁，一周后也死亡；5、不会出现培养基混浊，酸性变的情况，似乎不象污染；6、同一培养箱中的PA317细胞和293细胞生长良好。
我们曾经为此改变了许多实验条件：1、改用含血清的培养基（用于培养PA317细胞和293细胞完全正常）；2、改用其它品牌的新培养瓶；3、改用其它滤网；4、改变胰酶消化液种类和浓度、消化时间；5、改用培养基漂洗（代替PBS或Hanks）；6、订用新的生长因子和B27；7、请其它实验人员来取材；8、消毒，添加抗生素。但是，每一次总是重复同样的结果，已经要影响到毕业了，实在让人绝望......
恳求细胞培养高手指点！

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-11-7 15:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在附上照片几张

附件

2012-11-7 15:23

68767719.snap.jpg (51.63 KB)

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-11-7 15:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上一张是我们取细胞后静置细胞培养箱中约半小时后出现的情况。
肉眼就可以观察到细胞培养瓶底壁上附着一些粘稠物，
镜下情况如图，大量的细胞好像被什么东西“网”住了一般，
成束成团的出现。

注：刚刚取好细胞的时候在镜下是非常清爽的（如pheiphei所述）。

图2是成束出现的细胞带，而其他部位细胞就变得极为希少。

附件

2012-11-7 15:24

40253556.snap.jpg (25.39 KB)

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-11-7 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图3是24小时或者是48小时后，原先成团出现细胞团的改变。
细胞活力很差，而且许多已经开始皱缩、死亡，细胞碎片也很多。

附件

2012-11-7 15:28

71129895.snap.jpg (19.05 KB)

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-11-7 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图4 是偶尔在原先细胞团、束的地方出现的神经球
一般在培养48小时后出现
其细胞活力欠佳，而且可以看到神经球之间有一些絮状、条带样物连接
这些就是最早的时候出现的“网”住细胞的东东

这些神经球我们在加血清的DMEM/F12培养基中培养，并放置有多聚赖氨酸铺被过的盖玻片。未见有分化，细胞状态也未见好转。

附件

2012-11-7 15:29

22586989.snap.jpg (22.1 KB)

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-11-7 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

补充说明及疑问：
1、在取材的整个操作过程中，到300目（孔径是否太小？是否对细胞有影响？）细胞滤网过虑、然后离心、去上清液，再加培养基进行重悬——这个时候问题就已经出现了。重悬的时候，用滴管吹打离心沉淀下来的细胞（或还有其他东东），出现的是絮状物，不易吹开吹散。
2、接种到细胞瓶中的时候，细胞状态非常好。细胞的折光性很好，绝大多数是单细胞，碎片也不多，没什么组织块的（300目滤网过虑的）。
3、图1、图2出现在接种后半小时，12－24小时尤其明显。

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-11-7 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢楼上给我们的建议，谢谢您的帮助！^_^
并请教您说的“增加消化次数和时间”中，增加消化次数是什么意思？
是消化结束后，再换新的消化液再次消化吗？
还有，一般你是用多少浓度的胰酶、消化多长时间阿？

接下来我们会在消化这一环节上再做尝试。

同时恳请广大战友能给予我们帮助！
谢谢！

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-11-7 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

根据你的指教，我们改善了胰酶消化条件，细胞确实有明显不同，但现在观察时间还太短，正在进一步试验！
可能我们一直太保守，不敢高浓度长时间的消化，谢谢！

huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态离线

发表于 2012-11-7 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在培养神经干细胞时也出现过这种情况，我任为你可能是消化细胞时间过长，细胞核裂解释放出粘稠的RNA。如果你取的是胚胎tissue我建议不用胰酶消化,直接机械分离，过200目网试一下。

jkobn[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75366
精华 0
积分 468
帖子 574
信誉分 101
可用分 3711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态离线

发表于 2012-11-7 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得你细胞消化存在问题的可能性比较大.消化时我们采用分段消化:首先按PBS:0.25%胰酶=2:1的比例加入胰酶,边消化边吹打,消化3分钟左右,收集第一批细胞,用含血清的培养液中和所收集到的细胞中残存的胰酶.剩余的组织块按PBS:0.25%胰酶=1:1的比列加入胰酶,吹打消化5分钟,收集第二批细胞,同样用含血清的培养液中和细胞中的胰酶.剩下的组织快最后用0.25胰酶消化8分钟左右(不加PBS,不超过10分钟).收集细胞,加含血清的培养液中和胰酶.最后合并细胞离心后用培养液重悬细胞进行培养.

一般消化两次,细胞已经够用了.

我觉得你的细胞消化过度了,条索状的粘稠物可能是细胞碎片和组织快聚集成的,细胞慢慢死亡是因为细胞受到胰酶损伤较严重.
如果还是不行,换用胶原酶,效果也许会好许多.

12 1/2 1 2 ››