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标题:【求助】胰酶消化时间

月牙牙[使用道具]
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发表于 2012-11-7 19:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】胰酶消化时间

我看了很多资料，大部分贴壁细胞用0.25％胰酶消化时需要不到3分钟的时间，但是我每次消化细胞时却总需要5分钟以上的时间，而且这时有一部分细胞已经漂起来了，还有一部分细胞却没有变圆（培养瓶内细胞并没有完全长满），这时如果吹打，会出现部分细胞消化不下来的情况，所以不得不增加消化时间，通常会损失一部分细胞，细胞状态也有一定影响。想请问一下，如果排除胰酶质量的问题，还有什么别的原因？
附消化方法：倒掉培养液，用2毫升PBS洗一遍，加入2毫升0.25％胰酶后放入培养箱。
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-11-7 19:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议你用含有0.02%EDTA-Na的胰酶（0.25%)消化，但要注意的是这样配的胰酶消化作用非常强，我一般都是先把胰酶倒进去润湿培养瓶底后马上倒出，再等半分钟左右加入培养基吹打，效果还不错
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-11-7 19:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不要急，你可以试一下用5ml的酶液消化，在培养箱中培养3-5分钟就完全可以。拿出后，水平微微振摇，你会看到大部分贴壁细胞已经脱落。再加入5ml含10%胎牛血清的培养基中止消化即可。当然，在加入酶液之前最好也用5ml的PBS给细胞洗澡。
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月牙牙[使用道具]
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发表于 2012-11-7 19:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果配成0.25％胰酶＋0.02％EDTA消化后可以不经过离心步骤吗？
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2012-11-7 19:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你说的情况我以前遇到过，当时也急够戗！呵呵，加了0.02%EDTA就好了，我加的不是EDTA-Na。
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发表于 2012-11-7 19:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也碰到过这种情况，有可能是血清没洗干净，我的方法是，25cm的培养瓶用3毫升PBS洗两遍，把血清彻底洗干净，再加1。5或1毫升胰酶消化（放在温箱里）3-5分钟，没有消化不下来的
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发表于 2012-11-7 19:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不同的细胞胰酶的消化时间也不一样.我现在养了好几种细胞,也没有出现过你的这种情况啊,我消化细胞最长的时间也没有超过两分钟,而且也没有加了胰酶之后便放在培养箱里.我是在室温下消化的(天冷了,可以放在培养箱里消化).你的胰酶的PH值是多少?建议PH在7.5~8.0之间比较好.
胰酶作用及溶解的最佳PH是8~9,配制激酶溶液应将液体调至PH8.0左右,充分溶解,过滤除菌.过滤后可将溶液再调至PH7.5,也可不调.
我是用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶,效果不错!!
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发表于 2012-11-7 19:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

实际上，这也很正常，要看你的ＡＴＶ配的情况，还有你的细胞张的情况，如果ＡＴＶ配的不是很好，是有效成分下降，用的量少了；细胞张的太老，贴壁太久，不易脱落；不同的细胞消化的时间也不一样；还有你用PBS冲洗细胞，如果里面含有ca.mg离子的话，对于ＡＴＶ的影响是很大的，我们一般都是用的无钙镁水（ＣＭＦ）冲洗；用的冲洗液和ＡＴＶ的温度也对反映有影响，所以一般先要在温箱和温水中先预热一下，即使如此有时我们消化细胞还是需要很长的时间．只要细胞的形态和生长情况不受影响，应该没有问题，只是消化的时间长一点而已，我记得我最长的一次，消化了有大概３０分钟都没有下，我一气之下，倒了直接拍打下来，当然这样的细胞有太多成团，不好吹散，但是应该可以满足做实验的需要！！
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发表于 2012-11-7 19:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议胰酶中加0.02%EDTA
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发表于 2012-11-7 19:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

所谓尽信不如无书，做实验不可以以书上或是参考书上的标准未定，有时经验很重要，有时可能胰酶由于刚刚配制，活性比较好，消化所需时间可能比较短，有时由于胰酶放置时间比较长，活性略有下降，消化所需时间可能要长一些，但是都要以一个标准：
1，随时在镜下观察，看到细胞变圆就要立即终止消化，防止胰酶对细胞的过度损伤，个人经验：
2，胰酶从4度冰箱拿出后，在37度先孵育5分钟，以促进其活性最大发挥。
3，对要消化细胞，可以现在碎冰上放置3－5分钟，促使细胞伪足搜收缩，以利于消化。
4，一定要注意，消化前要现用不含小牛血清的培养液或是PBS涮一下瓶底，以去除残余的小牛血清对胰酶活性的抑制作用。

其实，以上几点，细胞版已经都有很多战友发过类似的帖子，自己只是把自己的经验和以前战友的经验总结一下，对于细胞培养关键还是自己在做之前拿一下练手细胞多练一下：比如消化，冻存，复苏等，关键还是靠自己的动手能力，别人再说，自己不练还是没有用，祝楼主好运！
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