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标题:【求助】MTT的两点疑惑，望高手解答之！

喇叭花[使用道具]
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发表于 2012-11-8 12:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】MTT的两点疑惑，望高手解答之！


1.双波长和单波长检测：用570nm和630nm双波长检测得出的最终结果在0.1-0.3之间，不加任何东西的空白孔测出来是0.001;
用570nm单波长检测得出的结果在0.2-0.6之间，不加任何东西的空白孔测出来是0.038
统计分析出来用单波长检测的方差齐性，且各处理组之间的差异有统计学意义。但双波长的结果方差不齐。Why？一般较好的吸光值在什么范围？
2.关于裂解液：加MTT后四小时，直接加100ul三联裂解液，37度放置过夜。问题是这裂解液太Smelly，能不能放在室温，不放培养箱？作用时间能不能缩短到一两个小时？
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-11-8 12:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不是太明白你为啥要做单波长和双波长的比较，一般用MTT法测我只看到用570nm测得（当然也有可能是我知识有限），我附了一些相关的文献。在这我说说我的方法：培养板中加入MTT，终浓度为0.5mg/ml，继续培养4~6h，吸去培养基，加入200ul含10%SDS的0.01mol/L HCl，37°C振摇，待紫色结晶完全溶解后，将溶液全部吸入96孔塑料培养板中，用DG-3022型酶标仪测定A570nm值，以A570nm值代表细胞活力。你也可以用DMSO代替含10%SDS的0.01mol/L HCl，效果没明显差异！
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发表于 2012-11-8 12:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我并非特意去做单波长和双波长的比较，只是双波长检测得出的最终结果在0.1-0.3之间，而用570nm单波长检测得出的结果在0.2-0.6之间，感觉单波长检测得出的结果更符合我心目中的数据。但好像双波长检测又更为科学。由于两种检测得出的统计学结果不同，所以我不知道到底差异是不是显著。
关于裂解液，我DMSO,三联裂解液和酸化SDS都试过。由于没有平板离心机，在吸去培液时，很容易损失结晶，造成误差，故用三联裂解液，不用吸去培液，而且在长时间内吸光值很稳定。对于这个问题，我昨天观察了一下，加入裂解液8小时，还是有约三分之一的结晶没溶。所以过夜加37度助溶还是有必要的。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-11-8 12:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像你们的实验条件比较好，呵呵。我只针对你的回复说一些：1）数值是否在仪器的准确读数范围确实是要考虑的，但我觉得，如果对溶解试剂的量进行一些微调，可能也能达到你的要求；2）我们也没有平板离心机，我们采用的方法是，直接加MTT，用移液器吸去孔中液体（枪头每次都是只碰孔最下端，使损失也大致平行），加溶解液。觉得整个实验中要想做到100％精确比较困难，一些地方只能说尽量，我们发现这样操作基本不影响实验结果。
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dog002[使用道具]
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发表于 2012-11-8 12:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也即将做这个MTT，还没有经验，但是附上我老板博士后文章的做法，不知对你有没有用，希望以后多多交流： 致密单层细胞经细胞因子或药物作用后，用冰冷的PBS液洗涤2次，加入0。5mg/ml MTT 100ul ，37度掺入4h，吸去残留液体，加入酸化异丙醇显色溶液100ul，30min内在595nm处用酶标仪测A值。观察细胞因子和药物对培养细胞生存的影响，选择合适的细胞因子和药物浓度。
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发表于 2012-11-8 12:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们加入MTT后，因为也是没有平板离心机，所以用小的ep管离心后，在加回孔中，每孔加150ulDMSO终止，然后用酶标仪测，只是用单波长测，我们的测量波长因细胞不同，用的是492nm，因为同样的样品反复做了多次，结果还可以。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-11-8 12:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外想指出的一点是所谓双波长，一个指参考波长，一个指测量波长。
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喇叭花[使用道具]
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发表于 2012-11-8 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这我知道，所以觉得用了参考波长去除了一些非特异性光吸收，照理得到的结果比单波长的更准确才是。但拿双波长得不到我想要的结果，所以想知道拿单波长得到的结果能说明问题吗
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-11-8 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是用490nm测的，不知道为什么每次数据都偏小，数据最大都在0.4之下，而且总是出现三个平行孔不平行，比如两个有颜色，一个无色
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-11-8 12:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加MTT之前，要去掉原来的加药培养液吧，接着要用PBS洗涤吗？
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