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微流体PCR和DNA测序让我们能够从大细胞群中挑出单个的细胞进行分析。现在研究人员正在生物学中发现全新水平的复杂性。

数十年来，研究人员一直是对细胞群展开分析。人们认为构成这些细胞群的单个细胞例如干细胞和肿瘤细胞差不多是一样的，细胞生物学家们采用的方法获得的都是这些细胞群特征的平均值。

德克萨斯大学MD安德森癌症中心的遗传学助理教授Nicholas Navin 说：“当前的方法是整体分析肿瘤，由此报告来自细胞群的平均信号。其缺点在于它可能掩盖了最丰富的、也是最恶性的肿瘤细胞亚群。”

然而现在，随着微流体PCR和DNA测序技术的进展使得从这些细胞群中分离出和分析单个细胞变得更为容易。而最让人惊讶地是，研究人员发现这些细胞并不完全相同。事实上，这些细胞群可能是由带有极其不同蓝图的几种亚细胞群组成。这一发现可以帮助癌症研究人员，例如追踪转移细胞。现在，科学家们正利用新的单细胞分析技术去发现哪些细胞具有哪些蓝图，以及是如何影响它们的表型的。

揭露干细胞的异质性

在美国斯坦福医学院，医学、心脏病学和放射学副教授Joseph Wu正在开发一种集成微流体电路用于单细胞实时PCR。这些设备仅需数皮克的RNA就可在单细胞水平上分析基因表达。利用这种方法，Joseph Wu和同事们揭示了采用常规实时PCR有可能看起来是一致的细胞群的异质性。

“从前，由于实时PCR需要数百至数千细胞的RNA，人们猜想收到相同胞外信号的一个细胞群体会对变化做出反应，具有相同基因表达模式。新微流体设备使得我们能够在细胞群内逐个细胞研究基因表达，并揭示了对环境反应可能的细胞异质性，”Joseph Wu说

例如，在近期发表的一篇论文中，Joseph Wu和同事们利用单细胞实时PCR微流体设备比较了人类诱导多能干细胞(hiPSCs)和人类多能干细胞(hESCs)的异质性。它们发现相比hESCs在hiPSCs中基因表达水平差异更大，表明一种不稳定的多能状态。此外，研究小组还发现hiPSCs的分化缓慢且不一致，这有可能会不利于其临床应用。

使癌症研究受益

德克萨斯大学MD安德森癌症中心的遗传学助理教授Nicholas Navin将随机抽取单个细胞遗传信息比喻为如同投票选举：它给予了你一种对群体多样性的统计学评估。“我们想在人类肿瘤中描绘出克隆的多样性，了解这一参数在评估侵袭、转移、存活和对化疗的反应中是否具有预测价值。利用单细胞测序我们能够在肿瘤中重建这些细胞系，并了解突变的年表。”



为了实行这种单细胞分析，Navin实验室利用了一套系统，包括流式细胞分选单细胞或细胞核、激光捕获显微切割、全基因组扩增和新一代测序。“单细胞测序将深远地改变我们了解复杂的细胞群。例如癌症的方式。”此外，利用单细胞测序研究人员还能够用罕见及有价值的样品例如癌症干细胞或循环肿瘤细胞来开展研究。“在这种情况下，标准方法将不会有足够的输入材料来发挥功能。不过，在这些工具准备进入临床应用前，仍然需要更多的努力来减少与扩增相关的错误。”

在冷泉港实验室，Navin的前博士后顾问Michael Wigler应用演化的观点来研究了癌症形成的遗传学。研究生Timour Baslan 说：“癌症研究人员之间有一个共识即肿瘤是通过获得导致失控性扩增的体细胞突变而进化的。但对于这一进化过程实际发生的机制普遍缺乏了解。我们的理由是，因为自然选择作用于个体，因此致瘤过程对单细胞发挥了作用，最终导致了肿瘤群。因此要全面掌握肿瘤演变必须要了解单个细胞。”

Wigler研究小组发现单细胞测序可以生成不同细胞类型的有价值的功能信息。Baslan说：“例如，通过测序来自成对原发和转移样品的单个细胞的基因组，我们确定了在原发肿瘤中更密切匹配转移性肿瘤基因组标记的单细胞基因组。在这个特定的实例中，我们可以推测出这些单细胞的功能是种植转移性肿瘤。”Wigler研究小组还利用成像技术通过表型鉴别了细胞，进而可以将表型与单细胞基因组信息关联到一起。

最终，单细胞测序有可能会在癌症的诊断和治疗中成为重要的临床和治疗工具。Wigler研究小组正与纽约纪念斯隆-凯特琳癌症中心(MSKCC)的 Howard Scher展开合作，利用临床试验中来自患者的样品。Baslan说：“我们正在绘制患者血液中循环肿瘤细胞的图谱。从长远来看，我们的目的是将来自循环细胞的单细胞测序数据与临床参数关联起来。”

此外，Wigler研究小组还与俄亥俄州立大学的Lyndsay Harris一起采用单细胞测序作为工具监控了患者肿瘤对治疗的反应。Baslan 说：“在未来，有可能会出现更多的应用程序，尤其是更多搜寻患者材料的非侵入性方法。其中一个例子是我们与MSKCC的Larry Norton博士合作，检测了利用细针抽取研究癌症基因组图谱的可能性。我们希望通过以非侵入方式获得单个癌细胞并绘制出图谱在不久的将来帮助指导临床中的治疗决策。”

解开DNA发夹

一些可实现单个DNA分子测序的新技术，即所谓的单分子测序也迅速地发展成为了单细胞分析的工具。单分子测序的一个有吸引力之处在于它绕开了扩增，减少了时间、成功和潜在的错误。一个例子是ABCD生物物理学实验室研究主任、巴黎高等师范学校( Ecole Normale Superieure)生物学和物理学系教授Vincent Croquette及同事们开发的一种DNA发夹测序技术。

他们的发现并非完全有意的。“最初，我们设计了一个实验用一个发夹来研究DNA复制，”Croquette说。他们利用磁镊子“解开”DNA发夹，DNA发夹的一端固定在一个表面。另一端在磁珠上。“DNA发夹是对复制叉的最小的物质，通过磁镊子可将两臂拉开。”当用磁力将发夹解开时，互补寡核苷酸能够与发夹链杂交，阻止当拉力减小时发夹再拉上。测量对再拉上的阻碍可使他们鉴别出何时已知的DNA片段杂交到了发夹上。通过利用他们的方法以及一种互补寡核苷酸连接的周期循环，这种寡核苷酸延伸了与发夹结构杂交的引物，从而他们能够获得一个未知片段的单分子序列。Croquette说：“我们还必须提高它的通量和读长以使其具有竞争力。原则上，它能够处理非常小量的材料，它的确具有单分子灵敏度。”