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标题:【讨论帖】蛋白质电泳技术超强支持,SDS,IEF,CIEF,CZE

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发表于 2012-12-3 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】蛋白质电泳技术超强支持,SDS,IEF,CIEF,CZE


蛋白质电泳技术超强支持,SDS,IEF,CIEF,CZE
欢迎大家发问!
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发表于 2012-12-3 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我先来问一个：
我做SDS-PAGE的，marker本来是七条，可是当指示条带跑出去的时候染色就剩五条了，也就是说前面两条带跟指示条带在一起分不开跑出去了。这是什么原因啊？如果缩短跑胶时间，前面两条带也是和指示条带在一起分不开。
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发表于 2012-12-3 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问你的胶浓度是多少的?一般的MK kit里都有提供他的蛋白在14%时的标准图谱.如果是胶浓度低的话,那肯定是跑掉了.再者就是你的胶的配方是怎样的,SDS的浓度并不是每个配方都是合理的.
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发表于 2012-12-3 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
12％的胶，但是以前跑5个小时的时候七条带分的很好。现在基本跑三个小时。
不过我觉得问题不在胶浓度上，应该是离子强度的影响。但是不知道是缓冲液还是loading buffer。
因为结果对我的实验目的没有影响，所以我也就没有做实验去验证，只是拿来这里问问大家。
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发表于 2012-12-3 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也想请教楼主一个问题
蛋白质组学中，作为完整蛋白质的分离，2D无疑具有很大优势，但是目前因为染色和凝胶分辨力的问题，一些低丰度的蛋白质用2D根本不能分离到。而在药物体外活性研究中，我们的目的蛋白是不明确的，也学没有分离到的低丰度蛋白就是药物的关键作用蛋白，不知楼主在平常的科研中是怎么解决这个问题的。会不会用到串联LC（MudPIT）？
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-12-3 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于蛋白筛选的问题是目前蛋白质组学的瓶颈,2D无疑是目前最直观和简单的操作,但是就现在的情况来说无法满足科研的要求.
但是我觉得样品的处理可以弥补他很多的缺陷.去除没用的高丰度蛋白,浓缩一下你的样品再做2D.当然这些不可能解决所有的问题,他终究是要被先进的仪器操作所代替的,尽管原理都是一样的.
大家肯定也接触过LC-MS等连用系统,刚开始的结果肯定是让人莫不着头脑的,而且重复性很差,但是国外就是这么做的,他们开始也是这样的感觉,但他们已经度过了那个不成熟期了.我们也最终会跨过去的,多做就会有规律发现的.
不知大家有没有接触过CE-MS,国外很火的,他就是由2D改进的,虽然也存在高丰度干扰的问题,但样品的处理可以获得很好的结果.
当然,你对目的蛋白应该有足够的认识,尽管你想说我就是要找一无所知的蛋白,但对相关蛋白资料你要接触的足够多!
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发表于 2012-12-3 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也想请教楼主一个问题，
　　前面说的＂去除没用的高丰度蛋白,浓缩一下你的样品再做2D＂，这个想法很不错，可是在目前有没有系统、可行而且有效的方法作到这一步？
　　另外，对于所谓的＂总蛋白＂，是一种什么样的含义？广泛到什么程度？
　　
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发表于 2012-12-3 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说句实话,大家基本上都知道干扰自己试验的那些高丰度蛋白无非就是些白蛋白之类的共有蛋白,如果不嫌麻烦,过下亲和层析柱就好多了,现在很多人已经是这么做的.
当然如果有钱的话可以买试剂盒啊,已经有的卖了,很方便的.
浓缩的话就很简单了.

"另外，对于所谓的＂总蛋白＂，是一种什么样的含义？广泛到什么程度？"
是什么意思?想问些什么!
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-12-3 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教楼主一个问题：
    在SDS-PAGE中，如果出现同分异构体怎么排除呢，也就是，表观分子量不同，跑非还原出现2条带？？？
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tie8[使用道具]
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 小中大

首先同分异构体跑还原型SDS-PAGE肯定没问题的,表观分子量完全一致.
而跑非还原型SDS-PAGE可能会分开的,这是真实情况的体现,不知道xiaowhy为什么要排除这种真相?
是出报告还是做什么?如果这些同分异构体是要得到控制的,那就需要进一步纯化,达到控制标准的要求.
如果这些同分异构体有同样的作用,没必要控制,那就跑还原型SDS-PAGE和非还原型SDS-PAGE都跑嘛,做对比补充报告说明嘛!
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