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标题:【求助】结直肠癌Transwell实验

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发表于 2013-1-5 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】结直肠癌Transwell实验


相关疾病：
结直肠癌
最近做结直肠癌（CRC）的Transwell实验，做了N次，都穿不过去，转染后48小时消化细胞做Transwell实验，

1:铺板
1, 将枪头置于-20度（以免胶过早凝固）
2，冰上操作且避免气泡产生
3，将小室置于24孔板上，1:7（胶MEM液）--每小室内铺80ul, 铺胶时将枪头剪掉
4，放置37度孵箱1小时待其凝固好
5，消化细胞后，PBS洗涤1次，用无血清培养基调整细胞密度为5或2.5×105，缓慢均匀滴入细胞1× 105 (胶穿)或5×104 （空穿）细胞（无FBS）。（总体积一致200ul）
6，将含有10%FBS的细胞培养液（700-900ul）加入培养板孔中。（加入的培养液要与小室内的液体平齐，空穿1250ul，胶穿800ul）
2：染色
1）0.1%结晶紫缓冲液染色半小时，将棉球将小室的内部擦拭干净。（主要是小室底部染色）

细胞株用过HCT116, LOVO HCT8 DLD1, 最多的空穿48小时，胶穿72小时，都不行，到后来细胞都抱团了，尤其是HCT8细胞很难得到单细胞悬液，加到杯子里后 也很容易抱团成片。
杯子是密理博8um的杯子，
请高手指点。
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发表于 2013-1-5 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
结肠癌
楼主难友啊！

我做结肠癌的RKO和HCT15也是没有穿过去，接种前血清饥饿24小时都没有用。师兄说之前他做都可以，可是人家休假去了。。。

楼主找到好方法了告诉我下。谢谢。
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发表于 2013-1-5 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是卵巢癌细胞，感觉穿过去后已经失去了细胞原来的样子
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发表于 2013-1-5 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

准备用密理博12um的杯子再试试
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发表于 2013-1-5 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近体系做了些优化,LOVO细胞空传8-9小时结果很好。
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发表于 2013-1-5 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
结肠癌
楼主，我和你一样苦命，也做结肠癌的。HCT116，HT29，SW620，不铺胶24小时，基本都穿不过去，48小时过去的还是很少。建议楼主换LOVO，我现在到处求LOVO，用它来做。如果楼主有LOVO，求馈赠一株，或者交换也行。
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发表于 2013-1-5 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

LOVO有啊，和你换HT29吧
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发表于 2013-1-5 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好！我最近也在做CRC细胞系的transwell，我的SW620和HT29也是48小时的时候基本都没穿过去几个。我想问一下你用12um的膜会好一点吗？体系做了哪些优化？你现在做这两种细胞24小时能穿过去多少？
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发表于 2013-1-5 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

密理博的ECM试剂盒对于大多数细胞来说，按照它的protocol都是穿不过去的，具体原因打了他们的客服也解决不了，不含ECM的试剂盒如corning的transwell还是能够穿过去的，但是这个模拟不了血管基质的环境，确实是个痛苦的实验，建议用他们推荐的阳性细胞试试
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发表于 2013-1-5 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好，我也用LOVO做迁移实验，在细胞库新买的一直没有养好，联系细胞库那边也不理会.我这边有HUH-7 hct116，请问您还有LOVO吗，希望能得到您的帮助。谢谢。
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