小中大各位电转的大虾：
自己最近在分离小鼠的原代细胞做电转，有几个问题困扰了很久。麻烦各位高人指导下。
1.电转缓冲液要用PBS，无FBS的培养基，还有Opti-MEM哪个比较好？或是自己配的缓冲液？
2.电转缓冲液的pH和电转冰浴的温度要严格控制吗？
3.电转的时间是根据要电转的质粒的片段长短来决定的吗？还是根据细胞的耐受力？
4.细胞的死亡率到多少比较合适呢？
5.原代细胞是从组织上消化下来就电转还是让他贴壁长几代再消化下来电转好呢？
6.什么时候加质粒好呢？是计数后加了混匀再一起放电转杯还是把细胞先加电转杯再把质粒加进去？
7.有什么高招可以提高原代细胞的电转效率呢？
问题比较多哈，麻烦大家了，哪方面比较了解可以挑着解答。有帮助的必定叮当送上！
大恩不言谢！
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这首先取决于你用的是那家的电转仪和cuvette. 你的问题大多在电转仪的instruction中均可找到答案.
比如, lonza 的Nucleofector, 它的技术资料是很全的.
当然, 如果你打算用Bio-Rad的电转仪, 相应protocol中也很详细, 比如电转缓冲液的要求, 电压和脉冲时间设定等.
个人觉得电转缓冲液只要符合protocol的电学基本要求差别应该不大, 象你列出的PBS, serum-free medium, Opti-MEM. serum-free medium和Opti-MEM相似, 对细胞有些营养保护作用, 而PBS没有任何营养成分, Opti-MEM在脂质体转染时比serum-free medium要好. 但所有这些对电转来说意义都不大. 而且, 只要时间短这个差别就更小了, 因为电转后细胞都是转入正常培养液培养的.
"电转缓冲液的pH和电转冰浴的温度要严格控制吗？"---pH应该是要严格遵循的, 不但影响电导还影响细胞活性. 至于温度, 如果电转产生瞬间高温, 那温度控制当然很重要; 否则实验室25度以下的室温, 我看不出有任何的不良影响, 实际上细胞不是大多养在37度吗? 这一点在instruction和protocol也有提及.
"3.电转的时间是根据要电转的质粒的片段长短来决定的吗？还是根据细胞的耐受力？"---这个在instruction和protocol也有阐述, 推荐的电转时间是适合大多细胞的, 但是也有个体化, 你可以查查有没有你细胞的相关资料. 如果没有, 你还是按推荐时间来. 总的来说, 时间越长, 细胞死亡越多, 但质粒转进去的可能性越大, copy number越多; 反之, 质粒转进去的可能性越小, copy number越少.
"4.细胞的死亡率到多少比较合适呢？"--->50%吧. 但总的来说, 电转就是一种transient transfection. 组间差异和每次做的差异都很大. 实验设计和分析时要考虑到. 理想的做法是质粒带荧光标记或药物筛选, 这样不管细胞死亡率是70%还是90%, 只要有细胞活着, 流式分选或药物筛选后就可以建stable cell line了.
5.原代细胞是从组织上消化下来就电转还是让他贴壁长几代再消化下来电转好呢？----如果细胞活力够好, 细胞数足够多的话, 可以直接电转; 否则还是传几代, 等细胞贴壁良好了再电转.
6.什么时候加质粒好呢？是计数后加了混匀再一起放电转杯还是把细胞先加电转杯再把质粒加进去？---这个差别也不大, 实际上决定电转效果好坏最重要的还是电压和脉冲时间. 还有一个终极方案: 就是脂质体转染和电转联用, 在Opti-MEM缓冲液中加入质粒和fugene (or lipofectamine), 按protocol incubate后加入到细胞悬液中, 细胞incubate后再电转. ///天下无不可转的细胞和质粒啊! 是不是很强? 可能lonza 的Nucleofector就是这么做的.
7.有什么高招可以提高原代细胞的电转效率呢？-----上面的终极方案还不够吗?! 那只好把细胞带到月球上电转了!
