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标题:【求助】请教有关用DCFH-DA测氧自由基的问题!

云端ing[使用道具]
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发表于 2013-1-13 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教有关用DCFH-DA测氧自由基的问题!


不知有没有人做过关以用DCF-DA kit 做抗氧化的, paper上写的好像有很多种做法, 有的是先加DCFDA, 30min 后PBS wash 2times 后再加药加H2O2 30min后观察效果; 有的先加药再加DCF-DA; 还有的加完DCF-DA后,还要加 N,N dimethylformamide dissolved cell?

请问 做 DCF要不要像做MTT一样要加DMSO 溶解cell 再读数?
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发表于 2013-1-13 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再请问DCFH-DA 用什么溶解, DMSO?
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发表于 2013-1-13 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过。我用乙醇溶解的：

配置：
DCFH-DA粉剂（sigma）3.5 mg溶解于721 ul乙醇中（这时的浓度为10.0 mM），之后用DMEM培养液稀释上述溶液10倍，配置成1.0 mM的储存液。

使用：
直接加入DCFH-DA溶液，调整终浓度为10 uM，37 °С 5 % CO2培养箱中静置0.5 h。无菌PBS小心洗涤3次后（很重要！），在激光共聚焦荧光显微镜下，选择488 nm激发波长和605 nm观测波长进行观察，并拍照。
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发表于 2013-1-13 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我染色的一张片子：


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2013-1-13 11:12
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发表于 2013-1-13 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上,非常漂亮的图片!
我没有激光共聚焦荧光显微镜, 我是准备用Victor 1420 Multilabel counter读数的,应该方法差不多吧?

另外,请问是不是上面方法是不是已在加完药处理(24hr) 后再加 DCF观察的?
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发表于 2013-1-13 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

急问！！有的Paper 说
The percentage increase in fluorescence per well was calculated by the
formula [(Ft30-Ft0)/Ft0* 100],
where Ft30=fluorescence at time 30 min and Ft0=fluorescence at time 0 min.
不知道,这里的Ft0 指的是不是未加DCF前的读数? 如果是这样的话, 那这个Ft0数值会很低, 而Ft30会很高, 那么一相除就会很大影响? (为什么不直接相减救行了?
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发表于 2013-1-13 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #6 云端ing 的帖子

1). 用一般的荧光显微镜完全可以做到。

2). 不同的药物，不同的细胞，作用的时间都不同。

3). Victor 1420 Multilabel counter读数是个好方法。

4). 好像应该为：[(Ft30－Ft0) / Ft30] x100％。
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云端ing[使用道具]
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发表于 2013-1-13 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wmp1234 于 2013-1-13 11:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1). 用一般的荧光显微镜完全可以做到。

2). 不同的药物，不同的细胞，作用的时间都不同。

3). Victor 1420 Multilabel counter读数是个好方法。

4). 好像应该为：[(Ft30－Ft0) / Ft30] x100％。 ...

我没看错, 是：[(Ft30－Ft0) / Ft0] x100％。
分母是Ft0, 有两篇文献都这样写!
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发表于 2013-1-13 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也想用DCFH-DA测定细胞内的ROS，我的目的是想测定抗氧化剂的作用。
看了几篇文献，说法也不一样。
我也想用荧光酶标仪来测定，也就是用黑色的96孔板来读数。
1、细胞接种在6孔板，处理因素结束后开始进行测定
2、倒掉原来的培养基，加入PBS稀释的DCFH-DA，终浓度为10uM
3、在37度温育30min
4、倒掉温育液，加入PBS洗涤3次
5、胰酶消化，用PBS吹成单细胞悬液
6、加入荧光酶标板（黑板子）进行测定。
这是我的实验的初步想法，不知道可以吗？请指教，谢谢！
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 小中大

请问大家，用荧光分光光度计测量ROS的时候，是不是只需要保证每管的细胞数一样就可以啦，ROS的单位就是纯粹的荧光强度，是吗？不用定蛋白的吗？？
因为我没钱作流式，不能很精确的定量细胞数目啊。
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