小中大【讨论帖】做transwell的进来,上皮细胞培养详细步骤
做了一段时间的原代细胞培养,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友共同探讨:
1. 将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管取出,置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV (Sigma),100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素(Gibco-BRL)、无Ca 2+、Mg2+,无血清的MEM。
2. 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞。
3. 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。
4. 冲洗过后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力,若存活率大于90%,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上(12 mm SNAPWELL, Costar),以37°C 5%CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。
5. 孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电生理试验。
显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片,(见坛内照片)。
根据试验的情况会及时更新,具体问题请跟贴,请大家多多关注哦!