小中大【分享帖】药物MTT实验步骤(贴壁细胞)
个人总结的MTT方法,希望和园友分享下,如果有错误或误解请大胆指出,你们的回复和建议是我前进的动力~~~
谢谢!!
药物MTT实验步骤(贴壁细胞)----个人改进版
by sssholy (2012-10-22)
1. 边缘孔用无菌PBS充填。收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度为50000个/ml,每孔加入100ul细胞悬液(每孔5000个细胞)。
注:⑴每次加入细胞都使枪头贴着孔底边缘(最好相同位置),缓慢加入100ul细胞悬液。孔加入顺序:可从上到下,从左到右依次加入。
⑵为了保证细胞密度均匀,最好每加3-5列细胞混匀一下细胞悬液,避免因重力沉降导致细胞密度不均。
⑶每块96孔板加完细胞后,应拿起板子前后左右水平摇晃几下(勿旋转摇晃),使细胞均匀分散。
⑷一般设6个复孔(B-G行),对照孔非常重要,且变异大,故设2列(2,3列为对照孔),4-10或4-11列为给药孔。
⑸边缘孔用无菌PBS充填, 2-11列均可加入细胞。因为要设置调零孔(即不加细胞孔),所以可将第11列设为调零孔,也可将第12列的无菌PBS孔在第2天加药时改为调零孔。
2. 细胞放入培养箱培养,待贴壁后第二天给药(通常前一天下午或晚上铺板,第2天上午给药)。给药方法:先配好药(用EP管配好药),再拿出96孔板,弃去原有培养液(可不用PBS洗,太麻烦了),加入药物。
注:⑴MTT加药时都是先配药再弃去原培养液,最后加入药物。切勿先弃去原有培养液再配药,因为配药一般要花较长时间,若先弃去培养液再配药会导致细胞无营养液体而死亡。
⑵药物是用母液溶于无血清培养基配成工作液,事先算好对照孔,药物孔,调零孔如何配制,如何设置加药顺序。一般越靠中央的孔变异越小,故最重要的给药孔一般放在最中间,次要孔放边缘,调零孔可用第11或12列。
⑶如果某个给药孔需加入2种药物,一般需要一种药物先预处理1-2h(预处理药物可用Ep管配好后再分别加入各孔),1-2h再加入另一种药物(直接加入各孔)。
3.细胞放入培养箱培养24h(或其他指定时间)。
4. 药物作用结束后,每孔加入20ul---MTT(5mg/ml),培养3-4h。若药物能与MTT反应,可先弃去原培养液,再加入含MTT的培养液(无血清培养液:MTT=5:1配制)。
注:MTT使用前预先解冻。MTT对光敏感,故一般保存于负20℃,配好5mg/mlMTT后我习惯分装于EP管中。
5.终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul---DMSO(DMSO可预先算好所需体积加入15ml离心管中),37℃温箱孵育10分钟或摇床低速振荡10分钟。之后用酶标仪检测OD—490nm(也有测570nm的)各孔的吸光度(A)值。
6.同时设置调零孔(无血清培养基, MTT, DMSO),对照孔(细胞,最大浓度的药物溶解介质,无血清培养基, MTT, DMSO)。
7.细胞活力(cell viability):
细胞活力(cell viability of control)=(药物组A值-调零孔A值)/(对照孔A值-调零孔A值)*100%