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标题: 【讨论帖】western blot问题解答

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【讨论帖】western blot问题解答

有关Western blot的问题请提问

我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

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鸽子不哭 [使用道具]




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能不能给我解答以下问题
从组织提的蛋白,分子量180kd,上样量40ug,70v,110v电泳,300mA两小时湿转,5%脱脂奶粉室温封闭2小时,santa一抗 1:500TBST稀释(推荐1:100-1:1000)4°C孵过夜,国产二抗1:2000TBST稀释(推荐1:2000-1:5000)室温2+小时。都是TBST洗膜3*10min。
发光剂是碧云天ECL PLUS。几乎整张膜都发光,像盏黑夜里的明灯,指引我走向失败。
第一张图是最开始曝的,第三张是过了一段时间曝的。中间一张是内参,似乎和目的蛋白是一样的情况。


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3
 
转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议:先做二抗的稀释度(同时不同的ECL均需检测)
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1:1000,1:2000,1:4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条,加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

good luck
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4
 
内参做成这样
说明操作上不是很严谨
或者说是整个步骤有问题
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5
 

内参的问题和目的蛋白应该是一样的吧。中央发白的区域是不是蛋白和一抗二抗所在的区域,是不是过多的酶把底物消耗完的缘故?
还有个问题,压片的时候要把PVDF膜放到两层塑料膜间,而我合上塑料膜的时候,发现一些本来发光的区域不发光了,是不是合上薄膜时ECL流动到了别的地方?怎么样操作才能保证压片时的效果和从ECL中取出时的效果一样?
今天把一抗,二抗的稀释度都翻了一番,变成1:1000,1:4000。试了santa 的ECL,结果还是一样。
RT干燥是routin 干燥?怎么操作?
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6
 
你说的很有道理
二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉
在你加上ECL的时候会很亮
但是很快就会减弱了
首先要保证二抗的稀释度合适才行
才能保证压片时的效果

另外你为什么要干燥?

WB过程是要避免膜干燥的
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7
 

还有就是在ECL孵育的过程中要避免金属等污染膜
会抑制HRP的活性
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米囡 [使用道具]




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8
 

最近去暗室曝光的时候,涂上发光液后膜上有很亮的一些点,曝光后的胶片上就成了麻点,非常难看,请楼主帮忙分析一下是什么原因啊
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NBA [使用道具]




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9
 

建议重换洗膜、稀释抗体用的缓冲液
前几天有个战友也有类似情况
她的问题是这样的:同一个抗体
一个用抗血清、一个用纯化后的抗体
结果抗血清的片子干净,纯化后抗体的片子和你说的一样
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wiwi [使用道具]




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10
 

最近做大分子200KD的蛋白,显色后条带不是窄条状的,而是沿着泳道散开成 一片,成竖带状的了,原因分析下
因为是200KD的,我用的6%的胶,电泳2个小时到溴芬兰出了胶停止的
以前有次用10的胶跑下来条带很漂亮,难道因为6的胶比较稀,蛋白压缩不好,电泳时间长了蛋白弥散开了?/??

选择湿转了2次,300ma/2.5h,转完预染marker都不是很清楚,立春红也没看见,转膜液是tris 25mM,Gly 192mM,Met 20%,SDS 0.1%,加水到1L,正负绝对没错,三明治也没问题,只好换半干1.5h, 预染marker转过去了,结果显色后就是楼上那样,郁闷
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