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标题:【讨论帖】western blot问题解答

xyw5[使用道具]
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发表于 2013-1-19 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想请教一下：我做的蛋白SUMO本身大小很小12KD，但是它可以修饰别的蛋白，与泛素类似，因此会blot下来，大小就比较大>100KD,我现在想在一块胶上做，请教一下转膜的条件：用多大孔径的膜，小孔径膜对大蛋白会有影响吗？转膜时间怎么控制呢？保证大分子量蛋白转过去，小蛋白会不会转过了呢？
谢谢
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发表于 2013-1-19 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xyw5 于 2013-1-19 12:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
想请教一下：我做的蛋白SUMO本身大小很小12KD，但是它可以修饰别的蛋白，与泛素类似，因此会blot下来，大小就比较大>100KD,我现在想在一块胶上做，请教一下转膜的条件：用多大孔径的膜，小孔径膜对大蛋白会有影响吗？转膜时间怎么控制 ...

这样的目的就得考虑用梯度胶了
5%至15%的梯度
转膜时间300mA 1h
0.22um孔径膜
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发表于 2013-1-19 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问下 资料上报道的用过氧化物酶为二抗，可否改为碱性磷酸酶二抗，对试验结果有什么影响？谢谢！
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发表于 2013-1-19 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 kent 于 2013-1-19 12:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，什么叫外源性内参，以血浆为样品时，如何在血浆中引入外源性内参

HRP与AP在显色方法上不同
HRP采用ECL系统
AP采用BCIP/NBT系统
当然可以改用了
HRP的敏感性比AP要高
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发表于 2013-1-19 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，什么叫外源性内参，以血浆为样品时，如何在血浆中引入外源性内参

===============================

血浆样品可以选择GAPDH作为内参
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发表于 2013-1-19 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
血浆样品可以选择GAPDH作为内参

===================================================================================

血浆中GAPDH不恒定啊，有没有文章使用这个方法的，若研究培养液上清，应该取什么内参，谢谢。在线等
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发表于 2013-1-19 12:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
血浆中GAPDH不恒定啊，有没有文章使用这个方法的

===============================

你可以搜索一下你研究课题的文献
看看他们做同样的蛋白用什么做内参
这样最保险
你也可以把目的蛋白名称告诉我
我帮你查
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发表于 2013-1-19 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以搜索一下你研究课题的文献
看看他们做同样的蛋白用什么做内参
这样最保险
你也可以把目的蛋白名称告诉我
我帮你查

==============================================================================================================

谢谢。不是做什么蛋白的问题，就是想用western 比较一下不同培养液上清中某种蛋白水平，相关文献只是在上样量相同的情况下半定量对比。我也只是要初步比较一下，看6种蛋白质中哪种表达差异最大，在后续再用ELISA测这种差异最大的蛋白在不同人群中的表达情况
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发表于 2013-1-19 12:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢。不是做什么蛋白的问题，就是想用western 比较一下不同培养液上清中某种蛋白水平，相关文献只是在上样量相同的情况下半定量对比。我也只是要初步比较一下，看6种蛋白质中哪种表达差异最大，在后续再用ELISA测这种差异最大的蛋白在不同人群中的表达情况

===================================

是这样啊
培养上清液中用什么样的内参我没有碰到过
不好意思
祝你好运
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发表于 2013-1-19 12:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

good luck

=====================================================================================================

您提到的检测二抗的稀释度，用的是新NC膜吗？并不是转过了蛋白的那个膜是吧，在一个膜上同时进行几个点杂交？谢谢啊
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