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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-19 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！我这有个结果想让你帮忙看一眼。
这个图上有野生型和重组型两种的细胞蛋白，一抗分别是针对GFP的多抗和针对m2 tag的多抗（这个是鸡多抗，故背景很多杂带），二抗是抗兔或抗鸡的。我的蛋白是融合的M2-EYFP，为什么图中都是三条带呢？请教过有个老师，他分析是isoform，你怎么认为？
谢谢先

===================================================

这几天我刚做了GFP的抗体检测与GFP标签蛋白裂解液的检测
我认为你请教的那个老师说的有道理
GFP有时会有小片段存在
另外一抗的稀释度调整下
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发表于 2013-1-19 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
六一的电泳仪湿转，仪器说明书上说是80mA 两小时之内完成，转65kD的时候可以做出来，但是同样条件做130kD没有条带，转膜时间延长至3小时，还是没有条带，麻烦指导一下。不胜感激！
电流能否改成100mA或者更大？
时间三小时还是再长一些？

============================

25mM tris
192mM glycine
20% methanol
0.1%SDS
配制完成后放置四度冰箱预冷
转膜时降温
130KD还是很好做的
300mA恒流 2h10min
祝你好运
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发表于 2013-1-19 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

TBST的PH值6.0是不是对抗体结合有影响？
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发表于 2013-1-19 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果曝光出来,泳道之间是黑色的,就是相邻泳道之间都是黑色的,什么原因呢?
是非特异性结合么,特异性不好导致?,为什么会在泳道之间曝出条带?
请指教.
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发表于 2013-1-19 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
TBST的PH值6.0是不是对抗体结合有影响？

===============================

抗体在中性环境下最稳定
pH5-8左右都可以
最稳定是7左右
另外稀释抗体的时候加了奶粉等
可以对抗体起一定的保护作用
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发表于 2013-1-19 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果曝光出来,泳道之间是黑色的,就是相邻泳道之间都是黑色的,什么原因呢?
是非特异性结合么,特异性不好导致?,为什么会在泳道之间曝出条带?
请指教.

========================

相邻的条带都连在一起吗？
上样量多少ug？
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发表于 2013-1-19 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了
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发表于 2013-1-19 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这两天做的结果背景较脏，并且有的时候没有信号。今天做封闭的时候发现前两次的封闭液配成了10%的脱脂奶粉。我想问一下，10%的脱脂奶粉对western 有什么样的影响。
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发表于 2013-1-19 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

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APS与TEMED的加的量有什么变化？
现在温度升高了
这两者的量是随温度变化而变化的
温度高要少加一些
可能是凝胶速度快
另外插梳子的时候要注意看
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 小中大
我这两天做的结果背景较脏，并且有的时候没有信号。今天做封闭的时候发现前两次的封闭液配成了10%的脱脂奶粉。我想问一下，10%的脱脂奶粉对western 有什么样的影响。

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10%的脱脂奶粉不会有什么问题
我怀疑你重复使用一抗
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