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标题:【讨论帖】western blot问题解答

pou[使用道具]
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相关疾病:
肿瘤
在文献中查不到在该肿瘤中VEGF具体是哪个亚型,我想找个能抗4个亚型的,在abcam公司有一个小鼠单抗,与人、小鼠反应,那几个都针对几个亚型,不知我是否可选这个小鼠单抗 ?
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QUOTE:
原帖由 pou 于 2013-1-19 10:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病:
肿瘤
在文献中查不到在该肿瘤中VEGF具体是哪个亚型,我想找个能抗4个亚型的,在abcam公司有一个小鼠单抗,与人、小鼠反应,那几个都针对几个亚型,不知我是否可选这个小鼠单抗 ? ...

当然可以的
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qianqin1977[使用道具]
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上清液中的蛋白WB本来就是一个问题
那你如何收集上清中的蛋白?
加入纯化好的beta-actin?
我觉得行不通

=====================================================================================================

我收集所有的培养液后,超滤离心浓缩。那如何设参照,还有什么办法比较吗?能不能在上量样相同的情况下,不要参照来比较?
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QUOTE:
原帖由 qianqin1977 于 2013-1-19 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
上清液中的蛋白WB本来就是一个问题
那你如何收集上清中的蛋白?
加入纯化好的beta-actin?
我觉得行不通

=====================================================================================================

我 ...

不好意思
分泌型蛋白我没这么做过
你要定量吗?
不定量的话不需要内参了
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可以试试IP
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qianqin1977[使用道具]
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不好意思
分泌型蛋白我没这么做过
你要定量吗?
不定量的话不需要内参了

==========================================

不要内参的话,保证上样量一样,可以作为半定量吗
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箭头儿[使用道具]
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我准备做细胞内的p-ERK和ERK,想问下磷酸化的蛋白跑时要注意些什么?还有胶的浓度要多少最佳?内参要用什么?可以用β-actin吗?但它和这两个蛋白分子量接近,我可以再加个样单独检测β-actin做为内参吗?也看到有用总ERK做为内参的,如果总的ERK量不变还要另外跑内参吗?
因为刚刚接触WB,有很多问题不是太明白,特请教,谢谢!
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QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2013-1-19 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我准备做细胞内的p-ERK和ERK,想问下磷酸化的蛋白跑时要注意些什么?还有胶的浓度要多少最佳?内参要用什么?可以用β-actin吗?但它和这两个蛋白分子量接近,我可以再加个样单独检测β-actin做为内参吗?也看到有用总ERK做为内参 ...

1,你可以选择beta-tubulin或者GAPDH作为内参
2,磷酸化蛋白要注意在蛋白提取的时候在裂解液中加入磷酸酶抑制剂,这是很关键的
3,可以选择用12%分离胶,5%浓缩胶
4,总ERK是作为磷酸化ERK的内参,但是还需要内参来定量ERK
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羊咩咩[使用道具]
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我看到您在回答不高兴和没头脑的问题时提到一抗和二抗都是用1倍TBST或PBS稀释。我们实验室里一抗用一抗稀释液稀释,二抗用5%牛奶稀释,这两种方法有区别么?是不是对结果影响不大?
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NBA[使用道具]
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所谓的一抗稀释液主要成分也就是TBST之类的
在封闭液中稀释抗体效果会好一些
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