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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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请问做WB的效价比度是不是越高越好啊
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请问,我最近做了些western,
小分子量的比如说21kd、20kd和16kd的P21、bax、survivin就都没有作出来。很迷惑。
我的条件是:上样总蛋白75ug,配10%的胶,电泳时最小为10kd的marker还留着,PVDF转膜湿转300mA 1h或350mA 1.5h都试过,封闭后一抗过夜。TBST洗膜,二抗1.5h,TBST洗膜。而后ECL显影。

内参37KD的GAPDH没有问题。条带很浓。但是小分子的P21,bax,survivin都没有出来。

我仔细搜索了版内大家的讨论:
对于转膜时间和电流大小 没有一致的看法:有人认为半个小时,200mA就够了。也有人转2h。有人用恒压转。
我一直都用恒流350mA转膜1.5h的,转30kd以上都没有问题。因为现在要做的是小分子,所以调成300mA 1h试过,虽然GAPDH可以出来,但目的蛋白没有。想问转膜条件到底应该如何?PVDF膜理论上应该不会使得蛋白转过头吧?
我需要做怎样的调整。
我今天做,自己初步的调整如下:
1、胶配成12%
2、加大上样蛋白量150ug
3、转膜时间是否也需要再减少?
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请问做WB的效价比度是不是越高越好啊

==============

1,一个是效价比
2,一个是特异性
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请问,我最近做了些western,
小分子量的比如说21kd、20kd和16kd的P21、bax、survivin就都没有作出来。很迷惑。
我的条件是:上样总蛋白75ug,配10%的胶,电泳时最小为10kd的marker还留着,PVDF转膜湿转300mA 1h或350mA 1.5h都试过,封闭后一抗过夜。TBST洗膜,二抗1.5h,TBST洗膜。而后ECL显影。

内参37KD的GAPDH没有问题。条带很浓。但是小分子的P21,bax,survivin都没有出来。

我仔细搜索了版内大家的讨论:
对于转膜时间和电流大小 没有一致的看法:有人认为半个小时,200mA就够了。也有人转2h。有人用恒压转。
我一直都用恒流350mA转膜1.5h的,转30kd以上都没有问题。因为现在要做的是小分子,所以调成300mA 1h试过,虽然GAPDH可以出来,但目的蛋白没有。想问转膜条件到底应该如何?PVDF膜理论上应该不会使得蛋白转过头吧?
我需要做怎样的调整。
我今天做,自己初步的调整如下:
1、胶配成12%
2、加大上样蛋白量150ug
3、转膜时间是否也需要再减少?

==============================

Bax与Bcl-2我刚做完
骨骼肌来源的
可以用15%的分离胶
最好用0.22um的膜
转膜时间300mA 1h,注意降温
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一抗浓度应该多试几个
我一般常用3个浓度梯度来做预实验
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我做得western的条带时好时坏,有时候能做出来比较规矩的一个棒状的条带,但有的时候条带形状非常不规则,蝌蚪型,哑铃型的,从中间断裂开的,只有半条的,上突下凹的什么都有,请教一下是什么原因,该注意些什么步骤以避免这种情况?

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我感觉不太像是电泳问题,因为使用的预染的marker,在SDS-PAGE的阶段条带还是比较整齐的,转膜缓冲液通常只重复用一次
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QUOTE:
原帖由 yonger 于 2013-1-19 11:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做得western的条带时好时坏,有时候能做出来比较规矩的一个棒状的条带,但有的时候条带形状非常不规则,蝌蚪型,哑铃型的,从中间断裂开的,只有半条的,上突下凹的什么都有,请教一下是什么原因,该注意些什么步骤以避免这种情况?

= ...

我认为就是电泳的问题
电泳之后染过胶吗?
如果有把图片放上来看看
中间断开或者哑铃型我认为是你转膜时胶与膜之间的气泡
另外杂交抗体的时候气泡没有赶好
在条带附近处孵育的时候留有了气泡
good luck
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第二张图蛋白上样量太大
减低5倍上样
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yonger[使用道具]
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我还有个问题,我可以在同一块胶上一组样上检测ERK,再重复加样后检测β-actin做为内参吗?因为我手头正好有β-actin,而没有你说的另外两种内参,我经费又不多,想看怎么能充分利用起来,
谢谢!
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yonger[使用道具]
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非常感谢你的意见。
考染做得比较少,我下次试试看,以前偶尔染过一两次感觉还可以
通常我制样就是加PBS用细胞刮刀收集细胞,放-20备用,用的时候就加loading buffer煮3-5min, 超声一下超断DNA,然后离心12000rpm 5min,取上清上样

你觉得转膜的时候只用一层普通滤纸会不会可能导致这个呢?
因为biorad的厚滤纸比较贵,所以用的一般的滤纸,一般推荐说是要上下各用3层,但是我发现三层滤纸很容易在层与层之间带入气泡,所以我就只上下各用了一层
另外,膜的质量问题有没有可能呢?

非常感谢
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