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标题:【讨论帖】western blot问题解答

purrr[使用道具]
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发表于 2013-1-19 11:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，我遇到了和“不高兴和没头脑”同样的问题了，用的也是santa cruz的p53的一抗，推荐稀释度1：100~1000，我试了1：400和1：200的一抗稀释度，用5%milk-TBST稀释的，二抗是进口的1：4000稀释的，也是整张膜都是亮的，就是没目的条带，挺郁闷人的。我做其它的蛋白，都用的是这个二抗稀释度，也还行啊。是一抗浓度太高的原因么。其它电泳，转膜，封闭，洗膜应该不会有问题的，因为做其它分子都还挺好的，准备做做这个p53的分子看看，结果出现了这个问题，盼解答，谢谢！
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发表于 2013-1-19 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，我遇到了和“不高兴和没头脑”同样的问题了，用的也是santa cruz的p53的一抗，推荐稀释度1：100~1000，我试了1：400和1：200的一抗稀释度，用5%milk-TBST稀释的，二抗是进口的1：4000稀释的，也是整张膜都是亮的，就是没目的条带，挺郁闷人的。我做其它的蛋白，都用的是这个二抗稀释度，也还行啊。是一抗浓度太高的原因么。其它电泳，转膜，封闭，洗膜应该不会有问题的，因为做其它分子都还挺好的，准备做做这个p53的分子看看，结果出现了这个问题，盼解答，谢谢！

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P53还是很好做的
先确定二抗的稀释度
再做一抗的预实验
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芙蓉宫主[使用道具]
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发表于 2013-1-19 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好：我想做个P糖蛋白的western blot定量，查了很多国内外资料基本上都是c219的一抗，辣根过氧化物酶的二抗，ECL显色。但是学校这边就有常规的鼠、兔、羊（碱性磷酸酶）二抗，BCIP/NBT显色，这样一套。由于学校的价格便宜，想在学校做。不知道这两个路线有什么不同，是否可以用学校的做？原来以为这两个途径差别不大，可是现在一抗买了，也是推荐辣根过氧化物酶的二抗，ECL显色。所以正在发愁，希望老师给点意见。
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芙蓉宫主[使用道具]
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发表于 2013-1-19 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

糖蛋白有拖尾现象
最好用BSA来封闭
ECL显色灵敏度高
我也建议你用ECL显色
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purrr[使用道具]
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发表于 2013-1-19 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目前 估计改ECL 不可能了 经费不允许
问下 用常规的鼠、兔、羊（碱性磷酸酶）二抗，BCIP/NBT显色，能否做P糖蛋白？ 除了注意BSA来封闭外 还应该注意什么？
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发表于 2013-1-19 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白是分泌到细胞培养液中还是什么？

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protein is in the wound fluid
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jkobn[使用道具]
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发表于 2013-1-19 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
protein is in the wound fluid

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like in the serum
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biabiade[使用道具]
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发表于 2013-1-19 11:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不要内参的话，保证上样量一样，可以作为半定量吗
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发表于 2013-1-19 11:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

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分离胶灌完后是用蒸馏水液封的吗？我以前用乙醇封也出现类似的问题，后来用水封就解决了。如果气泡不大，不会有影响的，我染胶试过。
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脱水萝卜[使用道具]
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发表于 2013-1-19 12:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在做小鼠脑蛋白的提取，用的是公司购买的RIPA裂解液，取一半脑组织约200mg，加1ml裂解液，10ul100mMPMSF，电动匀浆器，匀浆之后，冰上半小时，13，000rpm离心半小时，取上清，电泳
12%PAGE胶，电泳，考染后看不到15KD以下的条带，
请有经验的战友，指点一下，到底哪里操作有问题，提取小分子量蛋白有什么需要注意的地方，谢谢，我的目的蛋白11KD ，
另外我的小蛋白SUMO会和其他蛋白结合，也会杂下来我想同时看100以上的条带，是否该选择梯度胶，浓度范围应选择多少呢，期待解答，谢谢
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