生物实验技术

Illumina测序仪通常也被称作Solexa测序仪（Illumina测序仪的特点见表5）。它适用于采用各种方 法制备的DNA文库，文库中DNA片段可以长达数百bp，并可通过桥式PCR来扩增模板片段（图5b）。在 桥式PCR反应中，正向引物和反向引物都被通过一个柔性接头（flexible linker）固定在固相载体（solid substrate）上。经过PCR反应，所有的模板扩增产物就都被固定到了芯片上固定的位置。
值得注意的是，Illumina测序仪使用的桥式PCR与传统的桥式PCR有所不同，它会交替使用Bst 聚合酶 进行延伸反应以及使用甲酰胺（formamide）进行变性反应。这样，经过桥式PCR扩增之后，也会在固相载 体上形成一个个的模板“克隆”。一块芯片的8条独立“泳道”上每一条泳道都可以容纳数百万的模板“克 隆”，这样一次就可以同时对8个不同的文库进行测序。
经过上述PCR扩增步骤之后，所有的模板都被线性化处理（linearization）而形成单链模板，接着与测 序引物退火、杂交。随后使用修饰的DNA聚合酶和四种核苷酸混合试剂进行单碱基延伸测序反应（图6b）。 这些核苷酸试剂都经过两种方式处理过，它们都是可逆的终止子（reversible terminator）。这些核苷酸的 3’羟基端都有一个可被化学法切除的基团，这样每一次反应都只会掺入一个核苷酸，同时每种核苷酸都标记 上了可被化学法切除的不同颜色的荧光基团，以标识每种碱基。经过一轮单碱基掺入反应采集到信号之后， 就可以通过化学方法切除上述被掺入核苷酸上标记的两个基团，然后就能够继续掺入下一个核苷酸，重复测 序反应了。这种测序方法对36bp长度的序列测序准确率是非常高的，不过如果处理更长的序列，准确率就会 有所降低了。
表5 Illumina测序仪的特点



图5 克隆扩增模板片段。
（a）在454测序仪、Polonator测序仪以及SOLiD测序仪中广泛用来扩增模板片段的微乳液PCR技术示意图。首先， 体外构建好的两端连接有接头（如图中金色和绿色所示）的DNA文库在一个油包水（water-in-oil）的乳液环境中经 PCR扩增，由于此处只使用了一对针对接头的引物（有一条PCR引物的5’ 端被固定在微珠表面），因此进行的是 多模板PCR（multi-template PCR）而不是多重PCR（multiplex PCR）。另外，由于在模板浓度还很低的情况下， 大部分包裹着微珠的微乳液滴中最多只能有一条引物，因此经过PCR扩增之后，每一个微珠表面上都只会连接上一 种模板分子的扩增产物。打破微乳液滴，将这些携带有大量模板分子的微珠收集起来制成芯片。（b）Illumina测序 仪中使用的桥式PCR技术示意图。首先，体外构建好的两端连接有接头（如图中金色和绿色所示）的DNA文库经由 密集固定在载体上的引物（引物的5'端借助一个柔性接头固定在载体上）进行PCR扩增。这样扩增产物也会被固定在 载体上，PCR反应结束之后，每一个模板克隆都包含有1,000条模板产物。仔细检测模板浓度既可以保证在芯片上最 大限度地携带模板，同时也能避免模板过于拥挤的现象发生。