生物实验技术

一、集落刺激因子(CSF)的诱生
集落刺激因子(colonystimulatingfactor，CSF)是一组功能很强的骨髓造血细胞增殖因子，现已发现多种。根据它们在低浓度时的主要靶细胞，分别命名为粒细胞集落刺激因子(granulocyte-CSF，G-CSF)、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage—CSF，GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-CSF，M-CSF)。另外尚发现存在巨核细胞集落刺激因子(Meg-CSF)。且现已证实IL-5、IL-4、IL-3分别为嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞集落刺激因子。
通过体外培养CSF分泌细胞株，加IL-1促使其分泌CSF的产量增加。CSF分泌细胞株见表。
GY30 GY30R ALC-5
M-CSF M-CSF M-CSF
GM-CSF GM-CSF GM-CSF
G-CSF     

1．用胰酶消化分散GY30细胞，在含有5×10-5mol／L 2-巯基乙醇，10％胎牛血清的RPMI-1640培养液内，以1×106／mL细胞浓度，37℃培养24h。
2．吸去上清，以无血清培养液洗一次，再加入含有不同浓度IL-1的RPMI-1640液，37℃，5％C02温箱中培养12h，收获上清。
二、集落刺激因子(CSF)的测定
(一)生物活性检测法
1．骨髓细胞集落形成法
(1)用含有10％FCS的RPMI-1640培养液制备0.3％～0.4％的软琼脂。
(2)用淋巴细胞分层液分离得到骨髓单个核细胞，以3×104-5×104细胞／mL接种于软琼脂中，铺在无菌平皿内；37℃，5％C02温箱中培养14d。
(3)显微镜下计数大于或等于40个细胞的集落形成数，计算出集落刺激活力(colonystimulatingactivity，CSA)，计算公式如下：
CSA=集落形成数/105骨髓单个核细胞
2．依赖株3H-TdR掺人法
GM-CSF的依赖细胞株是DA3.15和IF-1； M-CSF和G-CSF的依赖细胞株分别是M14和NES60.4。操作步骤同依赖株测IL-3。
(二)分子生物学方法
利用CSF特异性cDNA探针，检测细胞中特定的mRNA表达，可用CLLYl+2-9细胞作对照。
(三)免疫学方法
同常规双抗体夹心ELISA法，该法能够检测到Pg／mL水平。国内已有试剂盒出售。