生物技术服务

　　1、培养基制备：

　　改良EC新生霉素增菌肉汤 (mEC)： EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素，使终浓度为20μg/mL。

　　改良山梨醇麦康凯琼脂(TC-SMAC)：山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液，使终浓度2.5mg/L，头孢克污，使终浓度为0.05mg/L。

　　MUG-LST肉汤：LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)，使终浓度为0.1g/L。

　　2、增菌培养

　　秤取25克样品放入225mL mEC中，均质。于41±1℃培养18-24小时。

　　3、分离

　　将mEC肉汤培养物10倍递增稀释。从10-4，10-5，10-6稀释度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培养18~24小时。

　　可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心，直径约2mm。

　　附：在梅里埃公司改良山梨醇麦康凯琼脂上的菌落。

　　4、鉴定

　　挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接种MUG-LST，于36±1℃培养18~24小时，出现产气，且无荧光者，分离到普通营养琼脂。

　　对纯菌落用EHEC O157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验，必要时进行生化试验。

　　在检测过程中，也可以在选择性增菌后，取出5mL增菌液，经100℃水浴15分钟灭活后，供自动酶联荧光免疫测试(VIDAS)，迅速获得初步结果，阳性反应者需作进一步证实。

　　附:自动酶联荧光免疫测试(mini-VIDAS)

　　自动酶联荧光免疫测试(VIDAS)测定程序

　　EHEC O157:H7检验程序图解

　　检样25g

　　↓

　　mEC225mL → VIDAS快速筛选

　　↓41±1℃，18-24h

　　10-4，10-5，10-6稀释度涂布TC-SMAC

　　↓36±1℃，18-24h

　　挑取5-10个可疑菌落接种MUG-LST

　　↓36±1℃，18-24h

　　MUG阴性培养物转种普通营养琼脂

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　　生化反应鉴定 　　　血清凝集鉴定

　　或

　　胶乳凝集试验

　　用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者，报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。

　　如需要进一步检测Vero毒素基因的存在，可通过接种Vero细胞或Hela细胞，观察细胞病变进行判定，或可使用基因探针检测和聚合酶链反应(PCR)检测法。(参见FDA细菌分析手册第8版)