蛋白质与蛋白组学

蛋白变性15分钟，与2*sample buffer 1：1混合，........

===========================================

楼主真的是按照这个顺序作的？先变性，后加buffer？

你的80ug样品上样体积大概是多少，如果量大孔小可以适当把浓缩胶做长点，可能拖尾会好点。另外一个，如果你提的组织煮了后有很多沉淀，也可能导致拖尾。建议顺一下（转速不能太高），吸上清点样。转膜300mA3小时，时间是不是稍微长了一点。如果没条带，除了染胶之外，也可以用丽春红染一下膜，看蛋白有没有转在膜上，或者有没有转过。

==============================================================================================================

体积是10ul，我提蛋白的时候取的是上清液呀，顺一下是什么意思呢？我也转过两个小时的，但是都没有。膜倒是也染过，看不出很明显的条带呢。

我个人觉得存在如下问题：
1. 浓缩胶是不是电泳的时间过短，在提速前是否看见MAKER都已清晰的分开。
2. 10%的分离胶的最佳分辨率在20~80KD，你的这两个蛋白是不是要考虑用8%（36~94）或者是6%（57~212）的分离胶跑跑。
3.貌似你的这两个蛋白都是膜蛋白，而膜蛋白用温和的PIPA一般不易裂解下来，是不是考虑用比较强的PIPA，加点比较好的PROTEASE INHIBITOR抽提蛋白。
4. 你的样本不多，为什么不考虑用10孔的梳子，你的蛋白上样量这么大(80ug,我一般就上10多ug)，这样小孔的胶当然会造成“一坨”带子，而不是一条带子.
拙见。

==============================================================================================================

哦，那我下次浓缩胶跑的时间长一点试试。 我也用过8%的分离胶，没什么改观。是膜上的受体蛋白。上样量虽然挺大的，可是从染的胶上看，目的条带还是不明显呀。

楼主真的是按照这个顺序作的？先变性，后加buffer？

=============================

是这么做的呀，有什么不妥吗？