蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

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标题:【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

有很多战友在关于包涵体蛋白的纯化以及透析复性这块存在很多疑问。我从事包涵体蛋白的纯化以及复性这块的时间比较长，有一些经验，希望能与大家一起分享、讨论。大家有什么问题和经验也可以提出来，共同探讨一下。
我先把园子里关于包涵体纯化和蛋白复性这块非常有价值的帖子整理出来供广大战友参考。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问老师,我想用色谱柱纯化包涵体具体怎么操作?
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8princess8[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你得先考虑你要用什么柱子，包涵体复性前还是后作纯化，如果是不复性就纯化的话，柱子能否耐受变性剂，等等。需考虑的很多，不是一句两句就能说得清的，并且详细情况大家也不知道，每个蛋白又有其自己的特性。
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发表于 2013-4-10 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个问题有些大，如果包涵体本身带标签（HIS或GST)那么可以考虑开始变性后用亲和层析，如果没有标签，那么和一般的蛋白分离也没有什么区别。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位老师指导,我看了一些关于包涵体用柱纯化的论点,所以也想尝试一下用凝胶柱.包涵体复性后作纯化,因为复性后是沉淀所以不知道怎么办?
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

包涵体溶解后过凝胶柱其实是一个复性过程，如果条件没摸好很容易沉淀，得到的蛋白也没有活性。建议你先用透析等方法先复性好，再纯化。有兴趣的话，摸好复性条件后再试着用变性剂溶解好的包涵体去上凝胶柱。
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发表于 2013-4-10 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

纯化包涵体？还是复性包涵体。估计是复性吧。复性可以先用稀释、透析、凝胶过滤等方法进行。前两种方法简单，你可以先用前两种方法先试一下。过凝胶较复杂，很多条件要摸。
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发表于 2013-4-10 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
　eg:NS5A2B融合蛋白的表达纯化　
NS5A2B融合蛋白以包涵体形式表达。包涵体用8 mol/L脲溶解, 分别用离子交换柱(Q2FF)和凝胶柱(G250)纯化后, 得到高纯度的NS5A2B融合蛋白(图3) , 浓度为0. 73 g/L。可以参考，嘿嘿，新手上路
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也听说过用带his tag的融合蛋白挂在镍柱上，然后通过缓慢的urea梯度洗，让它挂柱复性的
但是自己没有做成功过
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minran_1980[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知你是看什么文献上说用"用带his tag的融合蛋白挂在镍柱上，然后通过缓慢的urea梯度洗，让它挂柱复性的",如果是国内的,那你就没有必要在意了,可能是在造假.用这种方法是很难的,你降低urea浓度只能使之沉淀,并不能改变什么.不象在疏水柱上,蛋白的疏水区域与填料结合了,你降低urea浓度不会使之马上沉淀,从而起了一个复性的过程,因为大家多知道复性过程集聚沉淀大部分是由于疏水区域在发生作用的.我也试过"用带his tag的融合蛋白挂在镍柱上，然后通过缓慢的urea梯度洗，让它挂柱复性的",但也没成功
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