【求助】求救有关包涵体蛋白的纯化复性问题

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标题:【求助】求救有关包涵体蛋白的纯化复性问题

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发表于 2013-4-10 12:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好!
我现在做的实验是包涵体蛋白提起纯化方法的研究,工程菌是别人发酵做好的,几年前有个师兄也做过这个蛋白的初步提纯,他的论文上说,此融合蛋白的表达量占全菌的49%.可是我现在拿全菌裂解后跑12%的sds-page,用bangscan软件分析,融合蛋白的表达量只占全菌的15.5%.真是疑惑不解为何与他的相差如此之大.
另外,我洗涤超声后的包涵体(用0.5%的triton-x100熙两次,在用2M的尿素洗一次,目的蛋白未被洗出,)然后跑12%的sds-page,用bangscan软件分析融合蛋白的量才提高到17.75%.
后来我用10M的尿素裂解包涵体,现在就要进行复性了,可是目的蛋白这么低的含量,这么多的杂蛋白怎么复性呢,请各位大侠给个建议,小弟不胜感激!
天天面对这么郁闷的实验,觉得是在慢性自杀,呜呜呜...

NBA[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、是工程菌保存时间太长了的原因，可将工程菌重新活化。
注意：保存于甘油中的工程菌时间太长影响菌种的稳定性，一般不要超过1年，而且要定期（如半年）将保存的工程菌复苏，涂平板，重新挑菌落保种。
2、保存工程菌中的甘油浓度对菌种的稳定性影响显著，甘油浓度一般10-15%为宜。

火树银花nm[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议重新提质粒，然后重新转到表达菌株里面。我师兄就是这样的情况。

66小飞侠[使用道具]
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发表于 2013-4-10 12:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得你所说的问题不是包涵体变复性的问题，而是蛋白表达的问题。可能是你菌的活力不行，也可能是你表达的的条件没有掌握好，结果导致表达量不够，建议你从表达方面找一下原因。