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标题:【求助】Western Blot一抗二抗问题

紫烟[使用道具]
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发表于 2013-4-11 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western Blot一抗二抗问题

最近做WB，几个问题求教高手：
1.因为我的目的蛋白和内参离得很近，均在40kDa左右，想在一张膜上爆出目的和内参，用stripping buffer 洗膜效果不理想，现在想用两种荧光的二抗区分，请问一抗二抗该如何选择？如果我的一抗分别是兔单抗和鼠单抗，那二抗对应的羊抗兔（700通道）和羊抗鼠(800通道），可以吗？
2.两种一抗和两种二抗可以同时敷吗，有木有前辈的经验？
3.两种一抗要分单抗和多抗吗，还是只要来源不一样即可？？

万分感谢！！！请大侠们指教啊啊啊啊~~~
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-4-11 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以用GAPDH （37KDa）或者beta-tubulin （55KDa）作内参，没有必要这么麻烦
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发表于 2013-4-11 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有一个办法就是把胶多跑一些，让小分子量的蛋白跑出去，这样40-50左右的蛋白可以彻底分开，actin和目的蛋白只要分子量有区别就肯定可以做出来
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 小中大
你可以用GAPDH （37KDa）或者beta-tubulin （55KDa）作内参，没有必要这么麻烦

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试过用GAPDH，但分离的不理想，即使是电泳时间长，但跟目的蛋白差距不到10kDa，剪膜不好剪，还是要分开敷2次，费时间啊，想着一次就可以把目的和内参做出来，加上实验室就有2种二抗，所以。。。
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发表于 2013-4-11 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还是建议洗膜！你的stripping buffer 怎么了，为什么效果不好？我现在一张PVDF膜，上样量30ug， 一般能洗膜5次，就是做5个指标，你这目的和内参挨得近，不好弄的，还是建议洗膜！
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发表于 2013-4-11 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
距离10KDa应该足够把两个蛋白分开了，可以两个蛋白做在一张膜上面，不用剪开啊
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发表于 2013-4-11 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胶的浓度提高啊
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发表于 2013-4-11 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还是建议洗膜！你的stripping buffer 怎么了，为什么效果不好？我现在一张PVDF膜，上样量30ug， 一般能洗膜5次，就是做5个指标，你这目的和内参挨得近，不好弄的，还是建议洗膜！

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stripping buffer是生工的，洗过后蛋白都没有了，黑黑的一片！请教您的是哪个公司的？洗完后直接封闭继续下面的步骤吗？
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紫烟[使用道具]
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 小中大
距离10KDa应该足够把两个蛋白分开了，可以两个蛋白做在一张膜上面，不用剪开啊

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可能我之前电泳时间不够长，挨得很近！如果不剪膜的话就是再重新敷一次吗？
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2013-4-11 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是用thermo的，用量很少的！每次曝光完，先TBST洗1次，然后洗膜，按照说明书的时间洗，然后再TBST洗3次，每次10 min，最后才封闭！你那个一团黑，是不是洗过头了？或者你二抗浓度加太高了？我一般上样量是30ug，一张膜能退膜4-5次，就是出4-5个抗体指标。建议你要不要缩短洗膜的时间，降低二抗浓度试试！对了，你还没说你洗膜时间！！
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