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标题:【求助】分泌型蛋白做Western blot

dhpbj[使用道具]
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发表于 2013-4-11 14:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】分泌型蛋白做Western blot


要用分泌型蛋白做Western blot，想加药物刺激后分别从细胞的和细胞上清液中提取蛋白。但不知道细胞上清液提取蛋白的具体方法，好像还需要浓缩。谁做过的，可不可以分享下经验。最好有具体的操作方法。谢谢！
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-4-11 14:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过一段时间，谈谈自己的经验（注：不同的蛋白采用的方法可能不尽相同，希望楼主尽量采用文献中已经使用过的方法）。
从细胞培养上清中提取分泌蛋白的首先一步是将上清中悬浮的细胞碎片等去除掉，通常使用低速离心法去除。我一般采用800g，4C，5min离心两次的方法去除，之后再以12000rpm,30min, 4C条件进一步去除，经过这些步骤，基本上细胞碎片是去除干净了（有文献还用0.22um滤膜再过滤一遍，我通常省略）。之后根据分泌蛋白的大小选择合适的Amicon ultra超滤离心管，离心管的分子量选择以小于分泌蛋白的1/3作为标准（分泌蛋白为50KD则选择10KD左右的管）。将上清液体加入超滤离心管中持续离心浓缩样品，根据需要选择浓缩倍数，我通常为80X。
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dhpbj[使用道具]
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发表于 2013-4-11 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 utt0989 于 2013-4-11 14:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做过一段时间，谈谈自己的经验（注：不同的蛋白采用的方法可能不尽相同，希望楼主尽量采用文献中已经使用过的方法）。
从细胞培养上清中提取分泌蛋白的首先一步是将上清中悬浮的细胞碎片等去除掉，通常使用低速离心法去除。我 ...

谢谢你的回复，我想问一下，上清是提出来了，你是怎样提蛋白的呢？和提细胞的方法一样吗。谢谢
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NBA[使用道具]
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发表于 2013-4-11 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
millipore的超滤管可以浓缩蛋白 根据孔径大小浓缩不同分子量的蛋白
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dhpbj[使用道具]
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发表于 2013-4-11 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-4-11 14:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
millipore的超滤管可以浓缩蛋白 根据孔径大小浓缩不同分子量的蛋白

用超滤管浓缩蛋白这其中有很多不可控制的因素，首先滤膜的截留效果是一个大概范围，还有，滤膜虽然能够截留，但是也有孔径，残留一部分也是无可厚非的，此外，虑完之后你还得将滤膜上的样品转移出来，这里肯定也会有损失的
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-4-11 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
方法一：取上清，离心去掉细胞碎片之后，可以用上清直接做dot blot。
方法二：取上清，离心去掉细胞碎片之后，可以选择超滤管浓缩，或者冻干，然后做western blot。超滤管浓缩可能会损失一部分，冻干不会损失，但是需要冻干机。
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发表于 2013-4-11 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

TCA沉淀，丙酮洗后直接loading buffer溶解后上样。不过可能有较酸（loading buffer呈黄色）和盐离子强度的影响，使蛋白条带变宽。
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dhpbj[使用道具]
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发表于 2013-4-11 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 JK.jon 于 2013-4-11 14:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
方法一：取上清，离心去掉细胞碎片之后，可以用上清直接做dot blot。
方法二：取上清，离心去掉细胞碎片之后，可以选择超滤管浓缩，或者冻干，然后做western blot。超滤管浓缩可能会损失一部分，冻干不会损失，但是需要冻干机。 ...


dot blot是什么?谢谢
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-4-11 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #8 dhpbj 的帖子

细胞上清的dot blot需要专门的真空设备，跟DNA、RNA的dot blot还不一样。，可以不断的补充上样，通过真空抽吸设备把液体、小分子的都吸走，大分子的留在膜上，至于能留多大分子的，取决于你的膜。
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dhpbj[使用道具]
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 小中大


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原帖由 JK.jon 于 2013-4-11 14:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
细胞上清的dot blot需要专门的真空设备，跟DNA、RNA的dot blot还不一样。，可以不断的补充上样，通过真空抽吸设备把液体、小分子的都吸走，大分子的留在膜上，至于能留多大分子的，取决于你的膜。 ...

不好意思，初做实验，你说的这些设备又没有。我刚测了下细胞上清的蛋白浓度是459ng/ul。
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