【讨论贴】关于共聚焦激光扫描显微镜的一切问题

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标题:【讨论贴】关于共聚焦激光扫描显微镜的一切问题

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发表于 2013-4-11 15:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发现论坛里涉及共聚焦激光扫描显微镜的知识很少，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM) 是继电镜之后形态学上很先进的研究工具。它可以说是显微镜CT，可以进行光学切片，观察切面的多个层面，可以进行三维重建，又可以对靶蛋白等进行定量分析。这是其他的工具难以实现的。现在鉴于共聚焦激光扫描显微镜在科研中的应用也越来越多，在此发起有关共聚焦的话题。希望各位畅所欲言，有经验的请留下您的宝贵经验，比如共聚焦实验过程中需要注意哪些问题？共聚焦可以用来干些什么？有问题的也可以借这个平台在此发问。期待各位的热情参与

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发表于 2013-4-11 15:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
肿瘤
荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针,采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统
只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。

形态学研究：细胞凋亡、肿瘤细胞分类……

分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移——大分子构象的改变、受体与配体相互作用……

活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复——细胞连接间的信息沟通……

直接对活组织或整体胚胎观察

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发表于 2013-4-11 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

具体可应用于下列领域：
1.细胞生物学：细胞结构，细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结构和分布变化，细胞凋亡；
2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析；
3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学；
4.生理学：膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布、动态分析；
5.遗传学和胚胎学：细胞生长、分化、成熟变化，细胞组织的三维结构甚至再***的结构，染色体分析，基因表达，基因诊断；
6.神经生物学：神经细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离子内外流，神经组织（如大脑皮质）结构、细胞分布；
7. 微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）；
8.病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断，HIV，宫颈上皮细胞涂片诊断；
9.生物学，免疫学，环境医学和营养学；

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发表于 2013-4-11 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想知道一下：

1 研究大分子构象的改变时，怎么做荧光探针标记？
2 分辨率能不能达到 0.1 nm 级别？

谢谢！

mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-4-11 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知楼主在有没有用过共聚焦显微镜观察过转到植物组织中的GFP荧光，不知观察的条件和效果如何？能否看到保卫细胞，叶绿体细胞等结构，望指点一二，目前正在做细胞器的GFP荧光定位实验。

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发表于 2013-4-11 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼主，本人利用脂质体转染pSUPER-EGFP空载质粒到人CD4+T细胞系Jurkat细胞（悬浮），G418筛选后，PBS洗涤2次后上镜检测，发现荧光极弱，属于若有若无型的，但是同样质粒转染SGC7901荧光很强，请问该怎么处理

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发表于 2013-4-11 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主，提一个貌似跟共聚焦比较远的问题：如何用Image J软件分析共聚焦图片的荧光强度？或者其他软件也行。

gemei0115[使用道具]
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发表于 2013-4-11 15:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

共聚焦激光扫描显微镜主要是一个实验仪器使用问题，就是如何排出漂亮的图，如果分析这些数据。这些东西不动手操作几乎不能提出问题，而且仪器有厂家区别，因此操作也不尽相同。同时，仪器属于精密仪器，一般国内实验室有专人负责。看视野的和拍片子的不是同一人，因此很难真正自己去精益求精。这可能也是园内没什么人讨论这个问题的原因吧。
共聚焦激光扫描显微镜的应用确实可以很广泛，但原理的知晓对于具体应用其来进行实验研究并无太多帮助。就如果knockout小鼠，IPS的获得，原理大家都懂，但绝大多数人搞不出来一般，生物科学毕竟是门实验科学。因此建议大家提问实验操作中遇到的问题。
我遇到的问题是：
1.哪个公司的488二抗好用，在多处叠加扫描，或荧光信号较弱时不容易淬灭。
2.扫描时有些细胞核和所感兴趣的东西不在一个层面，如果使得叠加的图片更加漂亮。

wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2013-4-11 15:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.哪个公司的488二抗好用，在多处叠加扫描，或荧光信号较弱时不容易淬灭。

=========================

Alexa-488
当然，Dylight488也还不错
都用过

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发表于 2013-4-11 15:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

好吧，看到大家对confocal的热情。
传统我们都认为confocal是用来拍照的，就是成像研究方法，无论是你用染料，还是免疫荧光，还是质粒转染，都试图用confocal来拍照。好吧，那么你的confocol太省心了，这些顶多都是把它当作荧光显微镜或链接实时采集图像CCD的荧光显微镜。对于”共聚焦“，还没有好好利用。confocal相当于细胞CT，所以就看你怎么用了，其中根据它的光路和激光管的配置，可以做FRAp，Fret等，扫描可以线扫，3D 扫描构建，都是confocal轻松搞定的，而且是区别当今流行的活细胞系统或TIRFM的，所以要用好confocal，首先要了解confocal和你实验的目的和要求。当然前提你要有相关的染料或质粒。比如以往的染料，如flu3或flu5，confoal都只能提示半定量数据，而现在Fura2，就可以定量了。

另外，想提一点，有些实验者，先染色或转染，先上显微镜扫张图片，作为第一张，然后又拿回培养箱培养或加相关处理，然后又拿回显微镜，扫图片对比。这时候已经没有意义了，虽然你reuse你的上张图片参数，可是严格意义上，所有标本离开载物台就不能再和以前数据对比了，所以建议购买相关chamber，给药灌流细胞，当然你也可以自制这些。

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