【求助】【western blot】cleaved caspase 3求助

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标题:【求助】【western blot】cleaved caspase 3求助

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人用化疗药物诱导pc-3细胞凋亡后，提取蛋白检测活化的cleaved caspase 3，结果是一片空白，没有任何条带；但是分子量相近的BCL-2却有很好的结果；相反的，实验室其他人使用同样条件，检测RCC细胞的凋亡（未用药物处理，仅仅是naive的细胞），尽管条带很淡，却有阳性结果；实验条件如下：

实验室原来一直做组织的caspase-3，结果还行；做细胞的还缺乏经验。

gel： invitrogen的商业化胶版，4%-12%，每次电泳的时候，都确保溴酚蓝离胶版底部至少1cm即停止电泳；
转膜：iblot干法转膜，7分钟；pvdf和nc膜都试过
封闭：5% milk in tbst 2小时
一抗： cst 1:1000 过夜
二抗： 1:2000 2小时
ECL发光检测。
还望各位指教，谢谢。

831226[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
肾癌
你好，你那里的PC-3细胞可以交换么？我有肾癌7860细胞和膀胱癌细胞BIU87细胞

junhun[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也遇到同样的问题，我的是PANC-1细胞，药物作用后，CASPASE都出了，就是CLEAVE CASPASE不出来，

plaa[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问你后来有没有做出来CLEAVE CASPASE，有没有去探讨信号通路是非caspase依赖性的？我做了一个细胞的凋亡，做出了pro-caspase3,但是没有做出来cleave-caspase3，我觉得我的凋亡信号通路是非caspase依赖性的，可以吗？

popo520[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试试这种Western blot 多用途液，很好用。可以帮你节省很多的宝贵时间。
cuturl('http://item.taobao.com/item.htm?spm=2013.1.0.106.XrMJhT&scm=1007.77.0.0&id=19395523424&pvid=8d8bb283-9e8d-41d4-b956-0316cfce5afd&ad_id=&am_id=&cm_id=&pm_id=')

cocacola[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问你后来有没有做出来CLEAVE CASPASE，有没有去探讨信号通路是非caspase依赖性的？我做了一个细胞的凋亡，做出了pro-caspase3,但是没有做出来cleave-caspase3，我觉得我的凋亡信号通路是非caspase依赖性的，可以吗？

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有测caspase-3，-8，-9活性吗？，如果都没有，才行。

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有测caspase-3，-8，-9活性吗？，如果都没有，才行。

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我查看细胞信号通路，caspase有好多，3，7,6是执行凋亡的，我是不要把这几个都做了，如果执行凋亡的都没有切割活性，是不就可以不做8和9，直接确定是caspase依赖性的了？

cocacola[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我查看细胞信号通路，caspase有好多，3，7,6是执行凋亡的，我是不要把这几个都做了，如果执行凋亡的都没有切割活性，是不就可以不做8和9，直接确定是caspase依赖性的了？

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3/7底物是一样的，建议3，8，9都做，如果都没有活性，说明不依赖于线粒体或死亡受体途径，可能存在其他途径，如ER,P53等等

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

3/7底物是一样的，建议3，8，9都做，如果都没有活性，说明不依赖于线粒体或死亡受体途径，可能存在其他途径，如ER,P53等等

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我做了3没有切割活性，而8和9是引起3切割活性的，我能不能推测8和9也没有活性，否则8和9有切割活性，那3没有就不好解释了。

cocacola[使用道具]
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发表于 2013-4-11 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做了3没有切割活性，而8和9是引起3切割活性的，我能不能推测8和9也没有活性，否则8和9有切割活性，那3没有就不好解释了。

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怎么不好解释，如果排除了操作误差，说明在你这个细胞/组织处理条件下8和9存在其他effector caspase，也是个新发现；当然和你投稿文章的档次有关，如果你只想发个核心或者低分SCI，也是可以的。

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