【讨论帖】Western blot 不常规而实用的做法

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标题:【讨论帖】Western blot 不常规而实用的做法

applebook=213[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Western blot 不常规而实用的做法1、简单而有效的抗体洗脱液配方：0.2mol/L NaOH;
使用方法：蒸馏水洗两遍，5min/次；洗脱液摇床洗1次，5min；最后蒸馏水洗两遍，5min/次。

2、PVDF膜省时省封闭方法：仔细阅读Millipore PVDF膜的说明书，上面有介绍快速免疫学检测的方法，其中之一是可以省略封闭步骤，则可省1小时乃至2小时。方法如下：转印完成后，将PVDF膜放入甲醇中，静置10秒，取出放于滤纸上风干，等待10-15min，使膜完全干燥，然后直接孵育一抗，室温或过夜均可。其他步骤同常规。

以上两种方法均经多次实验验证有效.洗脱液效果很好;干燥膜孵育抗体后发光背景淡，条带清晰，甚至好于封闭后所得结果。特在此分享，建议尝试。

yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

简单而有效的抗体洗脱液配方：0.2mol/L NaOH;
使用方法：蒸馏水洗两遍，5min/次；洗脱液摇床洗1次，5min；最后蒸馏水洗两遍，5min/次。

我用这个方法洗了觉得洗得不干净呀，第二次显影还是显出原来的带！怎么回事？

junhun[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

都是骗人害人的贴，大家别信！我试过了，白片无光！

langlang[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家都说膜太干了会使背景比较高哦这样确实可以省时间可以试试嘿嘿谢谢楼主分享经验

Ao7[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 applebook=213 于 2013-4-13 10:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

Western blot 不常规而实用的做法1、简单而有效的抗体洗脱液配方：0.2mol/L NaOH;
使用方法：蒸馏水洗两遍，5min/次；洗脱液摇床洗1次，5min；最后蒸馏水洗两遍，5min/次。

2、PVDF膜省时省封闭方法：仔细阅读Millipore PVDF膜的说 ...

我们实验室都在用第二种方法做，效果很不错哦，大大减少试验时间。

standbyme[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谁能不能解释下第二个方法的原理呢？不是说在转膜之后膜一定要保持湿润不能干燥吗？会对蛋白浓度——就是条带深浅造成影响吗？

birdfish[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试一试吧，要是STRIP能够可以的话，那的确省了不少时间，第二个，请说明原因，尤其是别人都说膜必须湿润才可以的，而且不用BLOCK吗？

NBA[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我说说第二个的道理，但不是原理。
1.大家都知道PVDF膜在用前都要用甲醇泡下，然后放到转移buffer里泡着待用。这样是为了使PVDF膜始终保持湿润，因为只有湿润状态下他才能结合蛋白，至于这其中的原理，好像是啥极性还是啥的，记不得了。
2.如果转移完后，我们让膜彻底干燥，那么膜就会回复到不能结合蛋白的状态，所以就相当于封闭了。至于在甲醇中浸泡我觉得只是为了尽快的让他干燥，因为他挥发的快，膜很容易就干了。其实如果不用甲醇，放置室温长时间也能干燥。结果是只要干燥就可以了。但是切记要彻底干燥，不然湿润的地方由于下面的实验过程，很可能显影的时候会很亮。
3.也就是说，只要你下面的实验步骤中，膜不涉及到甲醇类的试剂（譬如乙醇等），干燥后的膜做完实验是没有问题的。

newway[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-4-13 10:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
简单而有效的抗体洗脱液配方：0.2mol/L NaOH;
使用方法：蒸馏水洗两遍，5min/次；洗脱液摇床洗1次，5min；最后蒸馏水洗两遍，5min/次。

我用这个方法洗了觉得洗得不干净呀，第二次显影还是显出原来的带！怎么回事？ ...

您是否可以把其中一次蒸馏水洗改成TBST洗，我们试了一下，感觉效果很好

鲇鱼少爷[使用道具]
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发表于 2013-4-13 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得值得一试,但我不知道转到NC膜上会不会也有这种效果呢？谢谢告之。

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