小中大【讨论帖】Western blot 实验心得 step by step
根据自己的实验体会，总结做好WB的一些心得，与大家分享，不当之处欢迎批评指正。叙述的思路就是围绕着实验的每个步骤展开，这样可能更具体些。
1．配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜。
常出现的问题有：A.凝胶出现花纹：此时应检查原料中过硫酸铵（AP）粉末是否受潮
B.凝胶聚合时间较长：聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢：此外还需注意环境的温度也很重要，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h，若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。
2．处理蛋白样品：该部分蛋白样品本身很关键，若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了；除此之外loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时将样品与loading buffer混合均匀也应注意。
3．电泳:首先在跑积层胶时应尽可能使样品压齐，若上样量较大（如细胞蛋白通常上样在20-30甚至40ul）,可适当减小电压跑20-30min，待压齐后方可开始分离。
4．转膜:该环节电流的大小，转膜的时间决定是否能成功将蛋白转上，而具体的参数应取决于所要蛋白的分子量大小，应反复摸索，本人在实验中得出的经验为：10KDa:200mA 1h; 60KDa 70V,2h；90KDa 70V,4h；200KDa 70V,6h. 此外还有如下几个细节问题需要注意：
A.膜的选择：PVDF还是NC,0.22μm还是0.45μm
B.转膜液中甲醇的量：通常在10%-20%，蛋白分子量较大时可适当减少，蛋白分子量小时应适当增加，建议先从15%开始。
5．封闭:该步骤一般不易出现问题，常见的有室温2-3h，或者4度封闭过夜，但仍需强调一点的是有些抗体的使用需配套使用特殊的封闭液。
6．一抗孵育:通常购买到一种新抗体后，还是建议先按说明书推荐的浓度比例在室温孵育2-3h, 若该抗体效价较好，应该显带很漂亮，尤其是在抗体刚买时间不长，然而事情往往不能尽如人意，我们在遇到一个不好的抗体时该怎么办？可通过延长孵育时间（如：4度过夜孵育甚至室温过夜孵育），增大抗体浓度，如果你想尽了一切可能结果仍然很不理想，建议还是换抗体吧，不要再浪费时间与精力了。
7．洗膜: 个人认为洗膜液洗3遍，每遍10min足以，没有必要过多次数过长时间，膜的背景不好很多时候并不是没洗干净，更多的应该去考虑抗体浓度是否过高等其他原因，本人实验过程中曾经做过两个抗体，其他的条件一样（甚至是从一张膜上剪开的），背景却相差很大，你能说是没洗干净吗？洗二抗同样如此
8．二抗孵育：选择好一个合适的条件不要轻易改变，另外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。
9．扫膜:本人的实验室使用的是odyssey机器，该机器及相应软件操作简便，使用起来也很智能，这里就不多说了。
以上是本人在实验过程中不断总结得出的一点小小体会，没有华丽的语言，没有高深的理论，只是希望能对刚刚接触western blot实验的朋友有点帮助，可能真正接触了实验后才能更好的去思考去总结，其实不只是western blot，可以说很多实验真的是细节决定成败，也许当我们认真做好每一个环节好的结果自然就水到渠成了，还是做个有心人吧，天才来自勤奋，成功源于积累！有什么新的心得体会，我将会及时补充，同时也希望各位战友批评指正！
