【求助】求问52KD、70-80KD分子量蛋白转膜时间？

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标题:【求助】求问52KD、70-80KD分子量蛋白转膜时间？

jude[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做的蛋白分子量为52KD、70和80KD，湿转，Bio-Rad Basic转膜仪，转膜液中加20%甲醇，不加SDS，膜是0.45um PVDF膜。。。。求问有经验的朋友推荐转膜时间？
前几次试了300mA 2h，结果都不好。今天改为200mA 90分钟，膜上预染marker还是比较清楚的，连最小的条带都留住了，但曝光时仍然是条带荧光非常弱，有时肉眼几乎看不见，压片后有时有泳道还会没有条带出来，相同样品的结果重复性差。不知道这种情况的原因可能是什么？是转膜过了还是转膜不够？（胶上和膜后滤纸都没有预染marker的印子）。。。

我查了文献有推荐转膜恒压50V 60min的，但作者没有注明是湿转还是半干转。。。另外查资料有人推荐是湿转90V 60min，不知道有没有人试过，效果如何？

转膜恒流和恒压有何区别？该如何选择呢？

附图：
300mA转内参 a-tublin：

附件

2013-4-20 13:43

19848556.snap.jpg (69.81 KB)

jude[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

200mA 90min转内参：有泳道没有条带，貌似也没300mA的好。

附件

2013-4-20 13:44

35099293.snap.jpg (24.03 KB)

mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个人觉得恒流转膜，在转膜过程中恒压的话电流越来越小，分子应该是随着电流过去。泳道不均一应该是要考虑三明治压实，同时最外侧边道上loadingbuf

remenb[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你这个话就是想当然了。估计你平时是恒流转膜，没做过恒压转膜。在恒流的情况下，随着时间的延长，电压会逐渐下降。但是在恒压的情况下，随着时间的延长，电流也是逐渐升高的。

remenb[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主做的几个蛋白分子量比较常规，建议你恒压转膜试试看，80V，90min，经验之谈。

wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室是350mA,2h，湿转.大家做这几个分子量的做的都很好

jude[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室是350mA,2h，湿转.大家做这几个分子量的做的都很好

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谢谢，关键你们用的是0.45um的还是0.22um的PVDF膜呢？

mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是0.22um的PVDF膜，湿转70伏，2个小时。也不错。

白白的[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的有个分子量是75kDa，用的湿转，5%甲醇，恒流200mA，2.5个小时，之前做的都不太好，后来有一次忘了加甲醇，反而出来了，条带很清晰。我用的膜是0.45um的NC膜。
后来在网上查了，说甲醇是为了对抗SDS的作用的，甲醇会缩小凝胶的孔径，阻止大分子量的蛋白从胶上转移出来，不知道楼主的甲醇含量是不是太高，可以试着降低或者不加试试，如果标本不是特别珍贵的情况下，毕竟我的经验有限，弱弱的在这发表一下意见，希望可以帮助到您，但是也希望不要误了您的大事，祝实验成功！

阿k[使用道具]
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发表于 2013-4-20 13:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我 80v 1.5h 做出来过

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