蛋白质与蛋白组学

包涵体在缓冲液中不溶怎么过柱子啊，应该只能复性之后再过柱子。

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您的理解有点儿偏差。

包涵体的溶解不是复性，而恰恰是叫做变性溶解。

变性液是可以过一些纯化柱的，不一定必需先复性。

问题是我的蛋白表达在包涵体内，包涵体蛋白是不是不能过柱子纯化？我查到GEMED公司有一种GST蛋白酶切试剂盒，需要在柱子中洗脱蛋白之前加入试剂盒中的试剂就可以将标签切掉。可是我现在不知道包涵体蛋白可不可以过柱子。或是我将复兴之后的包涵体蛋白过柱子，这样做可以吗？谢谢！请高手指点！

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您的问题要分几个步骤来说明。

1、包涵体蛋白是不是不能过柱子纯化？
但从字面意义上讲，不是。包涵体蛋白当然也是可以纯化的。具体怎么做你要多看一些有关包涵体纯化方面的资料。在版内搜索一下“包涵体”“纯化”关键词，有很多。

2、将标签切掉。
首先要明确两点。
其一，你构建的蛋白序列中有酶切位点存在。这样才有可能将GST标签切除。
其二，你的序列中的酶切位点是针对哪个商品化试剂盒的内切酶的。

3、我现在不知道包涵体蛋白可不可以过柱子。或是我将复性之后的包涵体蛋白过柱子，这样做可以吗？
包涵体蛋白经过变性液，如8M尿素或6M盐酸胍，溶解后，是可以进行柱纯化的。但是，不是所有类型的纯化柱都可以应用。
很可能你想用的是GST亲和层析柱，这种柱子在变性条件下GST的亲和效果很差，恐怕不能完成想要的吸附纯化效果。
包涵体蛋白经变性液溶解后，再去除变性剂进行复性，这样能不能吸附到GST亲和柱呢？答案是不一定。或者说吸附效果难以事先确定。这和你的目标蛋白的性质，以及你复性的方法、效果关系密切。

4、如果复性后的蛋白可以挂GST亲和柱，可以用试剂盒进行酶切去除GST标签吗？
答案依然是不一定。除了明确试剂盒是适用的外，还有下面的因素。
酶切的本质是一种蛋白质内部的水解操作。它和蛋白的性质相关。同样的酶，同样的酶切条件，对不同的带标签蛋白可能有着不同的酶切效果。
而且，就我来说，是不推荐用柱上酶切这种看起来比较“先进”的试验方法。特别是针对试验新手，针对没有做过酶切条件优化的新蛋白，更是不推荐。
将吸附的目标蛋白洗脱后，换液为酶切缓冲液体系。然后取小样做各种酶量和酶切时间的梯度，这是正道。

您的问题要分几个步骤来说明。

1、包涵体蛋白是不是不能过柱子纯化？
但从字面意义上讲，不是。包涵体蛋白当然也是可以纯化的。具体怎么做你要多看一些有关包涵体纯化方面的资料。在版内搜索一下“包涵体”“纯化”关键词，有很多。

2、将标签切掉。
首先要明确两点。
其一，你构建的蛋白序列中有酶切位点存在。这样才有可能将GST标签切除。
其二，你的序列中的酶切位点是针对哪个商品化试剂盒的内切酶的。

3、我现在不知道包涵体蛋白可不可以过柱子。或是我将复性之后的包涵体蛋白过柱子，这样做可以吗？
包涵体蛋白经过变性液，如8M尿素或6M盐酸胍，溶解后，是可以进行柱纯化的。但是，不是所有类型的纯化柱都可以应用。
很可能你想用的是GST亲和层析柱，这种柱子在变性条件下GST的亲和效果很差，恐怕不能完成想要的吸附纯化效果。
包涵体蛋白经变性液溶解后，再去除变性剂进行复性，这样能不能吸附到GST亲和柱呢？答案是不一定。或者说吸附效果难以事先确定。这和你的目标蛋白的性质，以及你复性的方法、效果关系密切。

4、如果复性后的蛋白可以挂GST亲和柱，可以用试剂盒进行酶切去除GST标签吗？
答案依然是不一定。除了明确试剂盒是适用的外，还有下面的因素。
酶切的本质是一种蛋白质内部的水解操作。它和蛋白的性质相关。同样的酶，同样的酶切条件，对不同的带标签蛋白可能有着不同的酶切效果。
而且，就我来说，是不推荐用柱上酶切这种看起来比较“先进”的试验方法。特别是针对试验新手，针对没有做过酶切条件优化的新蛋白，更是不推荐。
将吸附的目标蛋白洗脱后，换液为酶切缓冲液体系。然后取小样做各种酶量和酶切时间的梯度，这是正道。

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可是如果我只采用一个酶切体系进行酶切的话 将来如何将GST标签的蛋白和我的目的蛋白分开呢？我开始是考虑用一个酶切体系进行酶切，可是考虑到将来还要再次分离两个蛋白比较麻烦，就考虑用过柱，之后从柱上酶切。谢谢，请您指点！

我告诉你具体的路线：
1.诱导表达以后，裂解细菌，超声
2.离心，包涵体在沉淀中，所以去上清
3.用缓冲溶液洗涤沉淀，缓冲液的配方可以网上查，如何洗涤：震荡器上震荡使沉淀悬浮与缓
冲液中（沉淀应该尽可能震碎，这样才能洗干净杂质），然后放摇床上要30分钟
4.重复2-3若干次（3次以上）
5.最后一次洗完后，离心，收集沉淀
6.沉淀用2M尿素溶解，具体方法：震荡器上震荡，然后放摇床上要30分钟，跟洗的方法一样
7.离心，收集上清a与沉淀
8.沉淀再用4M尿素溶解，具体方法：震荡器上震荡，然后放摇床上要30分钟，跟洗的方法一样
9.离心，收集上清b与沉淀
10.沉淀再用8M尿素溶解，具体方法：震荡器上震荡，然后放摇床上要30分钟，跟洗的方法一样
11.离心，收集上清c。这时你要的蛋白基本上都在上清a/b/c中了（也就是2/4/8M尿素中）
12.上清c（含8M尿素）用含4M尿素的透析液透析至只含4M尿素
13.透析过的上清c与上清b（都只含4M尿素）用含2M尿素的透析液透析至只含2M尿素
14.透析过的上清c/b与上清a（都只含2M尿素）用不含尿素的透析液透析去除尿素，透析液的配
方网上查
15.（透析的过程就是蛋白复性的过程）透析完以后就可以用GST亲和柱吸附了
如果你做抗体，不建议用GST标签，建议用His标签的载体，His的标签比较小，可以不切除直接做抗原，GST的标签比较大，就不好说了。His标签的融合蛋白洗包涵体跟上面的方法一样。

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我在文献里看过这种方法，这种的优点应该比较温和，保证蛋白复性的效果，对吗？我的老师也建议我用his标签的做 就免去切标签这一步，可是我的his标签做的送去测序，一直不能测通，可能是载体有问题，于是就放弃了。那么切掉GST标签您有什么好的建议吗？谢谢！

可是如果我只采用一个酶切体系进行酶切的话 将来如何将GST标签的蛋白和我的目的蛋白分开呢？我开始是考虑用一个酶切体系进行酶切，可是考虑到将来还要再次分离两个蛋白比较麻烦，就考虑用过柱，之后从柱上酶切。谢谢，请您指点！

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柱上酶切为什么可以去除GST标签呢？你想过这个问题没有。

柱外酶切只是把同样的一个过程分成两步走而已。这样做的好处前面的帖子已经说明了。