【讨论帖】蛋白芯片制作与应用

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标题:【讨论帖】蛋白芯片制作与应用

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发表于 2013-4-20 14:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建立此帖目的是给大家提供一个蛋白芯片制备和应用方面的交流平台，有相关问题请在此发言：

愿在此就蛋白芯片的任何问题与大家交流分享，共同提高。

[ 本帖最后由 NBA 于 2013-4-20 14:40 编辑 ]

summerxx[使用道具]
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发表于 2013-4-20 14:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚刚接触芯片，老师能否教我常规做芯片的slide一共有多少种啊？谢谢!

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发表于 2013-4-20 14:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 summerxx 于 2013-4-20 14:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
刚刚接触芯片，老师能否教我常规做芯片的slide一共有多少种啊？谢谢!

1）与DNA芯片不同，蛋白芯片不能直接在原位合成，而只能采用点样或喷墨方法制作。
2）制作蛋白芯片最大的难题在于如何将蛋白与基底材料有效结合的同时，仍能保持其原有的生物活性（免疫原性、抗体特异性）不变。
3）可用于蛋白芯片的基底材料有很多种，其选择的基本要求为：①靶标蛋白以某种共价键或稳定的非共价键形式与基底表面连接；②其它蛋白、配体或小分子物质能够特异性地与所固定的蛋白发生反应；③非特异性吸附低；④稳定性好，有较长的保存期。
4）目前常用的基底材料有：硅片、聚丙烯酰胺凝胶、PVDF膜、NC膜、载玻片等，也有人使用CD盘作为基质材料。
5）最常用的还是载玻片，其中又有醛基化、巯基化、氨基化或环氧基等不同活化处理。

[ 本帖最后由 NBA 于 2013-4-20 14:39 编辑 ]

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发表于 2013-4-20 14:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再给你些更详细的解释：

1）载玻片是最最常用的蛋白质芯片的基质材料，但是要事先经过一定的化学处理。
2）Genometrix公司的Mendoza等人采用的载玻片处理方法是先用化学试剂氨丙基三甲氧基硅烷（Aminopropyltrimethoxysilane，APTES）（5％的乙醇溶液）浸泡洁净的载玻片10分钟，进行硅烷化反应，再用化学试剂进行进一步的处理，从而便于与蛋白质结合（Mendoza et al，1999）。
3）Harvard大学的MaBeath采用的则是另外一种方法，他们直接采用了美国TeleChem公司的SuperAldehyde载玻片。这种玻璃片是表面带有醛基修饰的载玻片。蛋白质N端的氨基或是其中赖氨酸所带的氨基可以和载玻片表面的醛基发生共价结合，形成希夫（Schiff）碱结构。也可以先在洁净的载玻片表面覆盖一层BSA分子，再用化学试剂对BSA进行活化。这样BSA中被活化的赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）和谷氨酸（Glu）残基可以和点到载玻片上的蛋白质发生氨基偶联或是形成脲的结构。但是这种共价连接方式可能会使得固定于载玻片表面的蛋白质不能保持原始的稳定构象，从而失活。而研究表明，由于蛋白质分子与载玻片表面的连接总是通过少数几个这样的共价键形式实现的，反而有利于蛋白质以各种可能的方式展现在载玻片的表面（MacBeath et al，2000）。
4）Yale大学的Synder实验室的Zhu等人制作的世界首张酵母全蛋白组芯片也是使用载玻片为芯片的基底。他们使用高效表达载体表达并且纯化出大约5800种酵母的蛋白，由于表达出的蛋白质都带有His tag，所以他们在玻片表面使用Ni2+进行修饰，通过亲和吸附固定蛋白质分子（Zhu et al.,2001）。

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发表于 2013-4-20 14:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

简单介绍一下蛋白质芯片的知识
研究蛋白质芯片的意义
1 。蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的物质层面；
2 。探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测；
3 。适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；
4 。有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。

蛋白质芯片的分类：
1，蛋白质检测芯片
2，蛋白质功能芯片
蛋白质芯片的制备：
1。固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）
2。蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解
3。点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等
4。膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h
载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白

5。微阵列的封闭固定微阵列上的蛋白样点
主要封闭试剂：BSA或Gly

kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-4-20 14:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 在蛋白芯片的制备中，结合在基质上的蛋白的来源，即这些蛋白是不是都是自己分离纯化出来的？
2 结合在基质上的蛋白对蛋白的纯度有什么要求？

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发表于 2013-4-20 14:41 资料个人空间短消息加为好友

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原帖由 kuaizige 于 2013-4-20 14:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1 在蛋白芯片的制备中，结合在基质上的蛋白的来源，即这些蛋白是不是都是自己分离纯化出来的？
2 结合在基质上的蛋白对蛋白的纯度有什么要求？

相关疾病：
乙型肝炎

你的问题只有通过文献回答较好。
1）在研究用蛋白芯片中，很多蛋白都是实验室自己纯化的，如以下3篇巨著：Ptacek J, Nature. 2005 Dec 1;438(7068):679-84.
Hall DA, Regulation of gene expression by a metabolic enzyme.
Science. 2004 Oct 15;306(5695):482-4.
Zhu H,Analysis of yeast protein kinases using protein chips.
Nat Genet. 2000 Nov;26(3):283-9.在偏重于临床诊断蛋白芯片中，很多蛋白可以商品化购买，比较大的可以提供人源蛋白的公司有Abnova和Genecopoeia。当然象国内喜欢做的乙肝、病毒、肿瘤标志物等，完全可以自己纯化（注意一点，国内肿瘤标志物自制成功例不多）。

2）结合在基质上的蛋白纯度要根据你使用的基质决定，不同的选材和表面衍生化处理对蛋白纯度要求不一。常规用的玻片对蛋白纯度总体要求不高

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发表于 2013-4-20 14:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发现30个差异蛋白, 欲明确这些蛋白在疾病变化过程中,在某组织中表达变化情况,运用蛋白芯片来检测,不知道可行不?

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发表于 2013-4-20 14:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

AFFYMETRIX系统是一个不错的芯片平台，尤其是用于核酸芯片方面，它的SNP很有特色，短核苷酸可以精确判定缺失及点突变，独创的多任务杂交装置的无效体积较小，单位样品点世界第一，但配套的扫描仪略显不足。

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发表于 2013-4-20 14:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 00无名指00 于 2013-4-20 14:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
发现30个差异蛋白, 欲明确这些蛋白在疾病变化过程中,在某组织中表达变化情况,运用蛋白芯片来检测,不知道可行不?

1）理论上完全可行，对几十到几百个这个范围的目标蛋白质而言，正是芯片发挥长处的地方，常规的酶免方法对同时研究30个差异蛋白而言往往力不从心。
2）为了检测这些蛋白在疾病变化过程中的表达变化情况，你需要用相应的抗体来制作芯片。
3）使用MALDI－TOF也可以达到类似实验要求。

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