【求助】小分子量蛋白的WB条件

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标题:【求助】小分子量蛋白的WB条件

qhyu[使用道具]
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发表于 2013-4-23 16:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求助了！
我最近在跑9kd左右的蛋白，总是没有条带出现。我的条件：
15%的分离胶，5%的浓缩胶，电泳60v，40min，80v，90min。湿转300mA 15分钟。以前用的是0.45微米的PVDF膜，现用0.22微米的PVDF膜，一抗是santa cruz的多抗，曾1：200，1：100做过，现浓度已经增加到1:50，还是没有条带出来，郁闷！
请教高手做小分子量蛋白的条件，还有想问一下，我用普通的marker（最小为11kd的条带）可以吗，定小marker太烦了，而且实验室就我一人做小分子蛋白，用的也不多，就想省事了。

04906[使用道具]
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发表于 2013-4-23 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的蛋白是9KD的，条件如下，分离胶我用的13％，浓缩胶我用5％，电泳我用过150－170V，大概时间40－50分钟左右，我一般会看Marker，我的Marker最小的带是10KD，总之看着marker跑的大概位置，不要让你的目的蛋白跑出去了。我用semidry转膜（20V，1－1.5 Hrs), 膜是0.45微米的。我怀疑你的蛋白是不是跑出去了。

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发表于 2013-4-23 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

也有可能你的抗体有问题。

831226[使用道具]
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发表于 2013-4-23 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、15％可以跑9kd的，你用的marker可以
2、像楼上说的你要验证一下是不是蛋白跑走了，跑胶时注意观察溴芬兰前沿，小分子不要跑太久，前沿接近胶底部就可以了。另外跑完胶染一下胶，看看你marker的11kd那条带在什么位置就可以知道你的目的蛋白有没有跑出去，差2kd一般两个位置会差不多
3、你转膜的时间感觉有点短，湿转不是半干转，一般300ma的话40－50min好一些，转完用丽春红染一下看看
4、如果你的marker的11kd那条带染胶、染膜都看的到，但目的蛋白做不出，你要考虑你的目的蛋白在样品中的丰度，还有你处理样品的方法，最后考虑你的抗体的问题。

qhyu[使用道具]
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发表于 2013-4-23 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位，marker 不需要染，跑完就可以看到最下面的11kd的条带，就是有些弥散，转到膜上也是可见的。我下面打算抗体浓度加到1:50试试看了，咳，实在不行就看能不能换抗体。

any333[使用道具]
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发表于 2013-4-23 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的目的蛋白是9kD,你用0.45um的膜也可以么？？不会因为孔径太大漏出去么？

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2013-4-23 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最好用ＰＳＱ膜，孔径更小

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-4-23 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问LZ你后来跑出来了吗？什么条件啊？怎么解决的饿啊？最近我也在跑一个9Kd的蛋白，搞得我是焦头烂额啊，哎
谢谢

qhyu[使用道具]
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发表于 2013-4-23 16:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用的小膜重复了好多次做出来的了

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发表于 2013-4-23 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵楼主我跟你太像了我的毕业论文做的就是10kD的蛋白小蛋白伤不起啊 marker一直在用最小10kD的预染Marker，最好用0.22um pvdf膜，也用过0.45的问题其实不大，我一直用湿转，效果还算不错，恒压80v 90min或者横流200mA 90min左右转膜，我敢保证不会转超过去！你有兴趣可以尝试一下。没有条带原因很多的，去看看这个wb no bands吧, 只要你确定问题不是出现在技术层面和抗原层面，那就考虑换抗体吧，有时候也需要运气呵呵同样条件再转一次就出来了有时候，很绝！

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