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标题:【求助】蛋白纯化不出来怎么回事？

IAM007[使用道具]
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发表于 2013-4-23 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白纯化不出来怎么回事？


我用原核表达系统表达了一个蛋白酶，在PET28a和PET30a载体上都有上清表达，但是怎么都纯化不出来，，，binding buffer 和elution buffer的缓冲液PH试过7.5、8.0、9.5（我的目的蛋白的等电点为8.9左右）但都没有结果。。
然后我又预测了一下目的蛋白的氨基酸组成，发现里面有5个Cys，是不是目的蛋白之间形成了氢键？？又或者是蛋白表达的时候将his标签包裹到里面去了所以不能与镍柱结合？？纯化了好久总没结果，烦躁啊，，希望各位大侠指点迷津
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发表于 2013-4-23 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的蛋白酶是不是分泌的，还是说胞内，会不会蛋白酶将标签切割了。。。。你用的是N端对吧。。。。假如是C端，是不是忘了删除终止密码子。你还试试其他的纯化方法，比如膜过滤等等，假如可以纯化出来，但是Ni柱不行，要么Ni柱有问题，要么操作有问题，要么就是his不见了。既然你的上清有表达，那么应该可以纯化的啊。而cys好像对应的是二硫键，不是氢键，以及这个只会影响活性，很少影响纯化的啊。
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发表于 2013-4-23 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 greenbee 于 2013-4-23 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的蛋白酶是不是分泌的，还是说胞内，会不会蛋白酶将标签切割了。。。。你用的是N端对吧。。。。假如是C端，是不是忘了删除终止密码子。你还试试其他的纯化方法，比如膜过滤等等，假如可以纯化出来，但是Ni柱不行，要么Ni柱有问 ...

我的蛋白酶不是分泌的，是在胞内表达的。我用的是PET28a载体，在此载体上N端和C端均有一个his标签，C端的终止子是在his标签之后的，也就是说正常情况下N端和C端的两个标签都应该能表达出来的，，
至于那个cys是形成二硫键，呵呵，我写错啦，我想说是不是因为蛋白里有这些cys才使蛋白之间、之内折叠，导致his标签被包裹到里面裸露不出来才不能纯化的？？哎，，郁闷啊，纯化 了好多次啦
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greenbee[使用道具]
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发表于 2013-4-23 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得和cys没有什么联系。而且你在跑胶的时候也确实能够看到上清表达啊，应该是有活性的啊。确实不行，就用膜过滤回收吧，只是多一些钱啦，不碍事。
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发表于 2013-4-23 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你用的是什么填料，换个填料试试，有时候蛋白本身标签暴露不充分等因素导致它本身和填料作用力弱，那就需要换作用力强的如配基密度高的填料，通常对这类蛋白作用力弱的可能挂不上。还有是不是表达量不够，上样太少
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发表于 2013-4-23 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得和cys没有什么联系。而且你在跑胶的时候也确实能够看到上清表达啊，应该是有活性的啊。确实不行，就用膜过滤回收吧，只是多一些钱啦，不碍事。

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额，没用过膜过滤回收，呵呵，可以一试，，谢啦
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IAM007[使用道具]
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发表于 2013-4-23 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你用的是什么填料，换个填料试试，有时候蛋白本身标签暴露不充分等因素导致它本身和填料作用力弱，那就需要换作用力强的如配基密度高的填料，通常对这类蛋白作用力弱的可能挂不上。还有是不是表达量不够，上样太少

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蛋白高手来啦呵呵，，，我做的这个蛋白挺好玩，表达量不是很固定，有时候多有时候少，，我们实验室用的填料就是那种Ni-NTA Agarose，都是老板买的，其他的填料没试过啊，什么填料结合比较好呢？
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发表于 2013-4-23 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是二硫键错配等原因导致his标签被包裹到里面，暴露不充分所以不能跟Ni柱结合了。
可以换离子柱、疏水柱试一试；或者加尿素，让蛋白全部或部分变性，得到纯品后再复性。
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发表于 2013-4-23 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果怀疑His被包埋，可用8M urea（Tris ph8.0)对少量样品进行变性, 用少量Ni-bead进行纯化，如果获得靶蛋白，说明His被包埋。如果不能获得靶蛋白，说明His标记丧失。
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cwcwcww[使用道具]
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发表于 2013-4-23 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
变形条件下所谓的包被不是标签在蛋白内部，而是很多分子形成了大聚合体而表面上根本就没有标签。二硫键很多，密度也高的包涵体用8M尿素很可能打不开，多加点还原剂如DTT, BME。 （注意填料本身是否能承受DTT）如果还不行的话需要6M盐酸胍和TCEP/TBP之类的强还原剂。
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